草珊瑚总黄酮稳定性研究

草珊瑚总黄酮稳定性研究内容摘要：

草珊瑚总黄酮稳定性研究 郁建生 罗显华 （铜仁职业技术学院，贵州 铜仁 554300） 摘 要： 以草珊瑚总黄酮含量为指标考察其提取液的稳定性，研究结果表明：乙醇提取法草珊瑚总黄 酮稳定性好，提取率高，其提取率是沸水提取法的 3.25 倍；在八种常见的附加稳定剂中以硫代硫酸钠、亚 硫酸钠对总黄酮的稳定性影响较大，可使总黄酮含量降低 21.98%～12.07%；草珊瑚提取液中总黄酮含量 在存放三年中平均每年降低 0.86%，在 100 ℃加热 30 min 后降低 0.82%，变化甚微，是非常稳定的；强光 直射 30 h 可使提取液中总黄酮含量平均降低 10.27%，对稳定性影响较大；提取液的 pH 值在 4～6 时总黄 酮含量最稳定。 关键词： 草珊瑚总黄酮； 提取液； 稳定性； 研究 草珊瑚[Sarcanrda glara (Thunb.) Nakai] 有名肿节风、九节茶、接骨金粟兰、接骨木等，系 金粟兰科草珊瑚植物，为多年生常绿草本或亚灌木，药、食两用。在我国长江以南各省均有 分布，特别是云、贵、川较为多见。草珊瑚叶苦辛、性温、有祛风通络、获取祛瘀、止血止痛、 接骨续筋之功效，民间常用来治疗风湿痹症，跌打损伤等 [1]及坐茶饮用，已有数百年的历 史。 现有的研究表明，总黄酮化合物是草珊瑚中含量最多、最主要的活性成分之一。草珊瑚 总黄酮具有抗菌消炎、清热解毒、抗多种肿瘤、促进骨折愈合、改善血液循环、镇痛、抗疲劳、 抗氧化、抑制流感病毒等多种生物活性[1-5]。急性毒性试验表明，草珊瑚及其提取物属实际无 毒；动物精子畸形试验，小鼠骨髓细胞微核试验等均为阳性，未发现致突变作用，所以是 非常安全的[6～7]。目前，草珊瑚加工产品有草珊瑚注射液、草珊瑚口服液、草珊瑚浸膏、草珊 瑚含片、草珊瑚片、草珊瑚胶囊、草珊瑚保健茶、草珊瑚奶糖、草珊瑚保健饮料、草珊瑚洗面奶、 草珊瑚牙膏、草珊瑚洗发香波等数十种之多[8]。草珊瑚在医药品、保健用品、保健食品领域中 的应用越来越广泛，但对草珊瑚总黄酮在不同状态下的稳定性研究尚未见报道。为了更合 理的开发利用草珊瑚资源，本研究以草珊瑚总黄酮含量为考察指标，分别考察了提取工艺 稳定剂、加热、pH 值、存放时间、光照、温度等因素对草珊瑚总黄酮稳定性的影响，研究保持 草珊瑚总黄酮稳定性的各种最佳条件因素，从而为生产中最有效地开发利用草珊瑚总黄酮 发挥草珊瑚的最大经济效益提供科学依据。 1 材料与方法 1.1 材料与设备 试验用草珊瑚全草均来自贵州省江口县梵净山岳同一地点，由铜仁职业技术学院重点 实验室进行鉴定及采用统一的干燥方法加工制样，避免背景干扰。 所用试剂 NaNO3、Al（NO3）3、NaHSO3、EDTA、吐温-80 等均为分析纯；标准品芦丁 （纯度大于 98％） 美国 Sigma 公司；乙醇为 95％食用酒精。 TU-1800 紫外可见分光光度计 北京普析通用仪器有限责任公司； RE-52 旋转蒸发仪 上海亚荣；不锈钢提取锅 武汉立中；PHSJ-3F 精密酸度计 上海雷磁；ALG5/10 自动灌装 封口机 上海国彩；电子天平 美国奥豪斯。 1.2 方法 1.2.1 草珊瑚总黄酮的测定方法 草珊瑚总黄酮的测定方法采用芦丁比色法 [9] ，测定波长 500 nm，回归方程为：C ＝ 84.317A-0.77361（相关系数 γ＝0.9997）；加样回收的平均回收率 99.37％，RSD1.85％（n ＝6）；精密度测定 RSD 0.85％。 1.2.2 草珊瑚总黄酮的沸水提取法 取草珊瑚全株（除根）干品粗粉 50 g，根据 L9（34）正交设计沸水提取筛选出最优水 平组合 A3B3C2D1 进行提取（即采用 100 ℃温度、加水量（固液比）10 倍）、每次 1 h，提 取 2 次）。合并提取液过滤，滤液浓缩至糖浆状时止，搅拌加入 95％乙醇至含醇量达 65％以上，以沉淀除去蛋白质、淀粉、脂肪、多糖等，过滤除去沉淀，减压回收乙醇，趁热 过滤，加等量水定容，并调节 pH 5～7 后冷藏静置过滤，得总黄酮粗提液，过 AB-8 型大 孔吸附树脂柱分离纯化，过柱完后用 60%乙醇洗脱，减压回收乙醇，过滤，按一定百分浓 度用蒸馏水溶解定容，得总黄酮提取液，按 1.2.1 方法进行测定。 1.2.3 草珊瑚总黄酮的乙醇提取法 取草珊瑚全草（除根）干品粗粉 50 g，根据 L9（34）正交设计沸水提取筛选出最优水 平组合 A1B3C3D3 进行提取（即采用 10 倍量 60%乙醇、80 ℃温度、每次 3 h，提取 3 次）。 提取后合并醇提液过滤，减压回收乙醇，趁热过滤，加等量水定容，并调节 pH 5～7 后冷 藏静置过滤，得总黄酮粗提液，过 AB-8 型大孔吸附树脂柱分离纯化，过柱完后用 60%乙 醇洗脱，减压回收乙醇，过滤，按一定百分浓度用蒸馏水溶解定容，得总黄酮提取液，按 1.2.1 方法进行测定。 2 结果与分析 2.1 提取工艺对草珊瑚总黄酮稳定性的影响（表 1） 表 1 提取工艺对草珊瑚总黄酮稳定性的影响 沸水提取法 总黄酮含量/ （µg/mL） 22.683 乙醇提取法 提取率/％ 总黄酮含量/（µg/mL） 2.13 提取率％ 55.432 6.93 对比表 1 中两种不同的提取方法可知，乙醇提取法草珊瑚总黄酮稳定性好，提取率高； 沸水提取法草珊瑚总黄酮稳定性差，提取率低；乙醇提取法对草珊瑚总黄酮的提取率是沸 水提取法的 3.36 倍。 2.2 不同稳定剂对草珊瑚总黄酮稳定性的影响 取草珊瑚全草（除根）干品粗粉，按 1.2.3 制成总黄酮提取液，取 8 份，分别加入不同 的稳定剂（加入量 EDTA 和吐温-80 为 0.1％，其余均为 0.2％）后 100 ℃灭菌 30 min，按 1.2.1 方法进行测定，结果见表 2。 表 2 不同稳定剂对草珊瑚总黄酮稳定性的影响 稳定剂 VC 偏重亚硫 亚硫酸 酸钠 氢钠 亚硫酸钠 硫代硫酸 EDTA 吐温- 未加 80 钠 颜色 浅棕红 浅棕红 浅棕红 浅棕红 棕红 棕红 棕红 棕红 pH 值 5.22 5.73 5.59 6.31 5.97 5.93 5.99 6.09 总黄酮含量 18.96 18.62 18.79 16.43 14.49 18.62 18.70 18.69 / （μg/mL ） 2.3 加热对草珊瑚总黄酮稳定性的影响 取草珊瑚全草（除根）干品粗粉，按 1.2.3 制成总黄酮提取液，取 3 份，100 ℃加热 30 min，按 1.2.1 方法进行测定，加热前后总黄酮稳定性变化见表 3。 表 3 加热对草珊瑚总黄酮稳定性的影响 样品 总黄酮含量/（μg/mL） 加热前 36.564 40.106 46.514 41.062 20050106 20050208 20050310 平均值 加热后 36.226 39.60 46.344 40.724 从表 3 可见，加热后 3 批样品总黄酮含量平均下降 0.338 μg/mL，占总量的 0.82％，变 化小是非常稳定的。 2.4 不同 pH 值对草珊瑚总黄酮稳定性的影响 取草珊瑚全草（除根）干品粗粉 3 份，按 1.2.3 制成总黄酮提取液，各取 8 份，分别用 NaOH 及 10％H2SO4 调不同的 pH 值，100 ℃加热 30 min，按 1.2.1 方法进行测定，结果 见表 4 及图 1。 表 4 不同 pH 值对草珊瑚总黄酮稳定性的影响（总黄酮含量：µg/mL） pH 2.9 3.9 4.9 5.9 6.9 7.9 8.9 9.9 未调 样1 样2 样3 18.113 21.832 20.543 20.896 23.977 22.434 21.084 24.543 23.415 22.414 25.667 24.657 18.788 21.685 21.125 18.125 20.875 20.474 16.511 19.136 18.847 14.570 17.294 16.943 22.112 24.985 24.258 表 4 结果表明，3 批提取液的 pH 值均在 4～6 时总黄酮含量最高最稳定。 2.5 自然存放时间对草珊瑚总黄酮稳定性的影响 取草珊瑚全草（除根）干品粗粉 3 份，按 1.2.3 制成总黄酮提取液，装入玻璃器皿中密 封， 100 ℃加热灭菌，在自然条件下存放三年，按 1.2.1 方法定期对草珊瑚总黄酮进行测 定，其稳定性变化见表 5。 表 5 自然存放时间对草珊瑚总黄酮稳定性的影响（总黄酮含量：µg/mL） 时间 样品 20010126 20010230 20010401 均值 200104 200404 200304 200404 33.483 17.776 31.267 28.175 35.314 17.607 31.014 27.978 35.061 17.439 30.677 27.726 34.724 17.186 30.424 27.445 从表 5 可见，三批提取液样品从 2001 年 4 月到 2004 年 4 月，在存放三年过程中总黄酮 含量平均每年降低 0.243 µg/mL，占总量的 0.86％，所以比较稳定，变化小。 2.6 光照对草珊瑚总黄酮稳定性的影响 取草珊瑚全草（除根）干品粗粉 3 份，按 1.2.3 制成总黄酮提取液，装入玻璃器皿中密 封， 100 ℃加热 30min 灭菌，分别在无光照下存放一年，室内光放置 30 d，强光下放置 10、30 h，按 1.2.1 方法定期对草珊瑚总黄酮进行测定，观察其稳定性，结果见表 6。 表 6 光照对草珊瑚总黄酮稳定性的影响（总黄酮含量：µg/mL） 样品 0 光照 无光照 1 年 室内光 30 d 强光 10 h 强光 30 h 20030201 20030202 20030203 21.467 19.484 19.157 20.036 21.253 19.329 18.993 19.892 20.980 19.041 18.451 19.491 20.310 18.451 17.860 18.874 19.462 17.439 16.764 17.888 均值 从表 6 可知，三批提取液样品无光照存放 1 年总黄酮含量平均下降 0.72％；室内光放 置 30 d 后平均下降 2.72％；受强光照射 10 h 后平均下降 5.80％，强光照射 10 h 后平均下降 10.72％；强光照射对总黄酮稳定性的影响较大，在存放时应避免强光照射。 2.7 温度对草珊瑚总黄酮稳定