鳄胆素联合阿霉素对人肝癌细胞SMMC-7721 抑制作用

鳄胆素联合阿霉素对人肝癌细胞SMMC-7721 抑制作用内容摘要：

鳄胆素联合阿霉素对人肝癌细胞 SMMC-7721 抑制作用 邓轶韬 1，丁玉梅 1，李华亮 1，2，董欣 2，沈雪莹 1，陈清西 1* （1 厦门大学生命科学学院，厦门 361005；2 广州鼍龙生物技术开发有限公司） 摘 要 本 文 研 究 了 鳄 胆 素 （ crocodile choline ） 联 合 阿 霉 素 （ doxorubicin ） 对 人 肝 癌 细 胞 SMMC-7721 的体外抑制作用．以不同浓度鳄胆素、阿霉素单用药组和两药联合用药组作用 SMMC-7721 细胞，应用 MTT 法和集落形成实验检测细胞增殖抑制、流式细胞仪分析细胞周 期分布、Western blot 检测凋亡相关蛋白表达．结果显示鳄胆素、阿霉素单药与联合均能抑制 SMMC-7721 细胞的增殖，且呈剂量依赖效应，两药联合有协同效应（P＜0.01）．集落形成 实验中对照组、鳄胆素单用药组和阿霉素单用药组的克隆形成率分别为 88%、30.8%和 28.5%， 而两药联合后几乎没有克隆形成，表明两药联合有显著的差异 ．细胞周期分析显示药物处理 组出现 S 期阻滞，联合组与对照组相比，S 期细胞含量由 12%上升到 59%；各组均能诱导 SMMC-7721 细胞凋亡，并以联合组效果更佳，细胞核经 Hoechst 染色出现浓染致密的固缩形 态和强蓝色荧光;细胞中促凋亡蛋白 Bax 表达上调诱导细胞凋亡．研究结果表明鳄胆素与阿霉 素联合对人肝癌细胞 SMMC-7721 有显著的抑制作用，作用效果具有协同效应．本研究有望 为肝癌的联合用药治疗提供理论依据． 关键词：鳄胆素；阿霉素；联合用药；肝癌；细胞凋亡 中图分类号：Q 356．1 文献标识码：A * 通讯作者：chenqx@xmu.edu.cn （陈清西） 基金项目： 厦门市科技计划项目：3502Z20133009，国家自然科学基金委基础科学人才培养基金科研 训练及科研能力提高项目(厦门大学)（基金号：No.J1310027）和厦门大学生物学科拔尖计划项目资助． 1 肝癌在全球范围内是一种发生率和致死率都很高的癌症，随着现代社会的发展，由于水 资源污染等造成肝癌的发生率居高不下，在中国的东南沿海一带更是如此．肝癌的临床治疗 主要是手术、放化疗与中药结合的方法治疗．阿霉素是临床常用的化疗药物，也是肝癌的推荐 用药．但阿霉素对正常细胞会产生一定的杀伤作用，造成较严重的心脏毒性和骨髓抑制作用， 在临床上的应用受到了一定的限制．药物联合可以减少用药剂量和增加疗效，从而降低药物 的副作用，并且能避免机体对其产生耐受．目前已有关于阿霉素联合其他化疗药物抑制肝癌 细胞的报道，但是通过添加另一种化疗药物来降低阿霉素的用量可能会来给机体其他的伤害， 阿霉素与天然药物的联合将可能真正降低化疗药物的副作用．随着中药研究的发展，动物胆 汁在医药上的应用愈发受到重视，中国药典已收载的动物胆汁制剂达到20多种．鳄胆汁是由 20种以上的胆汁酸、胆汁醇及中性的甾醇类组成，本实验室利用生化方法从暹罗鳄胆汁中分离 提取到的有效成分命名为鳄胆素，对胆管癌、肺癌、肝癌等多种肿瘤细胞有良好的抑制作用． 两者联合使用还未见报道．本研究探讨鳄胆素、阿霉素单独及联合作用对肝癌SMMC-7721细 胞的体外抑制作用，初步探索两药单独及联合作用时的药效变化，以期减少化疗药物的用量， 降低对机体的毒副作用，达到增效减毒目的，为药物的临床联合应用提供理论依据和支持． 1． 材料与方法 1.1 材料 鳄胆素由本实验室从暹罗鳄胆汁中提取分离，用 100% DMSO 溶解，-20 ℃保存，实验时 稀释，DMSO 终浓度＜1%；阿霉素购自上海生工生物工程有限公司；RPMI-1640 培养基购自 Invitrogen 公司；胎牛血清购自 Hyclone 公司； MTT 购自 Sigma 公司；人肝癌 SMMC-7721 细 胞由厦门华侨亚热带植物引种园惠赠． 1.2 实验方法 1.2.1 细胞培养及分组 人肝癌 SMMC-7721 细胞培养在内含 10%胎牛血清、1%双抗（青霉素和链霉素）的 RPMI-1640 培养基（pH 7.2），37 ℃，体积分数为 5% CO2 培养，取对数生长期细胞用于实 验．根据对细胞处理的药物种类及浓度进行分组，即对照组，鳄胆素、阿霉素单独用药组和鳄 2 胆素、阿霉素联合用药组．鳄胆素单独用药组的终浓度依次为 5、10、15、20 μg/mL；阿霉素单 独用药组的终浓度依次为 0.1、0.2、0.4、0.8 和 1.0 μg/mL;联合组用药组的最终浓度依次为：阿 霉素（0.2、0.4、0.8 和 1.0 μg/mL）+鳄胆素（5 μg/mL），阿霉素（0.2、0.4、0.8 和 1.0 μg/mL） +鳄胆素(10 μg/mL)和阿霉素（0.2、0.4、0.8、10 μg/mL）+鳄胆素（15 μg/mL）． 1.2.2 MTT 法测定鳄胆素和阿霉素单独或联合作用对 SMMC-7721 细胞增殖的影响 用 MTT 法测定鳄胆素单药组、阿霉素单药组和两药联合组对 SMMC-7721 细胞的抑制率． 取对数生长期的细胞以 6×103/孔密度接种于 96 孔板，每个浓度设置 4 个重复，每孔加入 200 μL 细胞悬液，置于 CO2 培养箱中培养 24 h 后，分别加入 2 μL 不同浓度的药液，对照组加入 相同体积的 DMSO，继续培养 24 h 后加入 20 μL MTT 溶液（5mg/mL），培养 4 h，弃上清液， 每孔再加入 150 μL 二甲基亚砜（DMSO），37 ℃充分溶解后，用酶标仪测定吸光度，测定波 长为 490 nm．按下式计算抑制率： 抑制率（%）=（对照组 OD 值－实验组 OD 值）/对照组 OD 值×100% 1.2.3 药物联合作用评价 采用金氏公式｛q=Eab/(Ea+Eb)-Ea×Eb｝判断两药不同药物浓度相互作用是否具有协同作 用，式中 Eab 为合用药物的抑制率，Ea、Eb 分别为 a 药、b 药单独用药的抑制率．若 q 值在 0.85～1.15 内为两药合用单纯相加，q 值＞1.15 为有协同作用，q 值＜0.85 则表示两药合用有 拮抗作用． 1.2.4 集落形成实验 取对数生长期的 SMMC-7721 细胞，分别以每孔 2000 个细胞接种于 60 mm 的培养皿中， 待细胞贴壁后，分别用鳄胆素、阿霉素及两者联合处理细胞 24 h;接着撤走药物刺激，用含 10%胎牛血清的正常 RPMI 培养基继续培养 2 周．除去培养基，PBS 洗 2 遍，无水甲醇固定， 结晶紫染色，统计集落形成数并拍照． 1.2.5 Hoechst33258 荧光染色观察 取对数生长期的肝癌 SMMC-7721 细胞接种于 6 孔板中，每孔含多聚赖氨酸处理过的盖 玻片，细胞贴壁后加入药物作用 48h．实验分为对照组、鳄胆素及阿霉素单药组、鳄胆素和阿 霉素联合组．取长有对照组细胞核处理组细胞的爬片，预热的 PBS 洗 3 次，然后用固定液 3 （甲醇：乙酸 = 3:1）固定 10 min，PBS 洗 3 次，滴加 10 µg/mL Hoechst 33258 染液室温避光 孵育 10 min，PBS 洗 3 次，稍微晾干，用含有抗淬灭剂的封片液封片，荧光显微镜下观察并 拍照． 1.2.6 细胞周期测定 将培养至对数生长期的肝癌 SMMC-7721 细胞按 1×105 ml-1 接种于 100 mm 培养皿中，培 养 24 h 后加入药物．药物处理 24 h 后收集细胞，4 ℃ 800 r/min 离心 5 min，PBS 洗 2 次后加 入 -20 ℃预冷的体积分数为 70%乙醇固定，4 ℃过夜．细胞上机检测前低速离心除去乙醇， PBS 洗涤 2 次，每管分别加入 500 μL PBS 重悬细胞，然后加入 10 μL 10 mg/mL RNase A，37℃孵育 30 min,转入冰浴，加入 25 μL 碘化丙啶（PI）染液 (10 mg/mL)，染色 30 min,300 目绢筛过滤，于 EPICS XL 型流式细胞仪中进行检测，所得数据用 ModFit LT 3.3 软件 进行细胞周期分析． 1.2.7 细胞内总蛋白的提取及免疫印迹 取处于对数生长期的肝癌 SMMC-7721 细胞，经过不同浓度的药物处理 48 h 后，离心 （1000 r/min, 5 min）收集贴壁和悬浮的所有细胞，PBS 洗 1 次，离心，弃上清，加入预冷的 细胞裂解缓冲液和蛋白酶抑制剂，混匀，冰上裂解 30 min,每 10 min 漩涡震荡一次；4 ℃, 13000 r/min,离心 10 min，取上清用 Bradford 蛋白浓度测定试剂盒测定总蛋白浓度，用 PBS 调 节蛋白浓度使每管总蛋白浓度相同．每管加入等体积的 5×Loading buffer 上样缓冲液，沸水中 煮沸 5 min 使蛋白变性，取 20 µg 总蛋白上样，12% SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，将凝胶上蛋 白转移至硝酸纤维素膜上，5%脱脂牛奶封闭，TBST（10 mmol/L Tris-HCl, pH7.2, 150 mmol/L NaCl，0.05% Tween 20）缓冲液洗膜 3 次，每次 10 min，一抗孵育过夜，相同方法洗膜，加 入 HRP 标记的二抗孵育 1 h，相同方法洗膜后，滴加 ECL 化学发光底物于 PVDF 膜上，在暗 室中进行胶片曝光、显影和定影． 2 结果与分析 2.1 MTT 实验结果 MTT 实验结果显示，鳄胆素、阿霉素单药组和联合作用组对 SMMC-7721 细胞都有增殖 抑制作用，且呈浓度依赖性，药物浓度越高，抑制作用越强．单独作用 24 h 时，鳄胆素对 4 SMMC-7721 细胞的 IC50 = 22.28 μg/mL，阿霉素对其 IC50 = 1.17 μg/mL．两者联合作用时，低 浓度鳄胆素（5 μg/mL）与不同浓度阿霉素合用，其联合作用呈拮抗作用；中浓度及高浓度鳄 胆素与不同浓度阿霉素组合，其联合作用由相加转变到协同作用．由表 1 可以看出，鳄胆素 为 15 μg/mL、阿霉素为 0.4 μg/mL 时，两者协同作用最为显著，达到相同作用效果时能显著降 低阿霉素的浓度，降低阿霉素所产生的毒副作用．后续实验均采用这一浓度组合（鳄胆素 15 μg/mL、阿霉素为 0.4 μg/mL）． 表 1 鳄胆素与阿霉素联合作用对肝癌 SMMC-7721 细胞的增殖抑制作用 Table. 1 Inhibitory effect of combined treatment with crocodile choline and doxorubicin on the prolif