流感病毒性肺炎小鼠自然杀伤细胞毒性相关信号转导通路差异基因表达及两种不同治法中药方剂的调控作用研究

流感病毒性肺炎小鼠自然杀伤细胞毒性相关信号转导通路差异基因表达及两种不同治法中药方剂的调控作用研究内容摘要：

· 322 · 中华危重病急救医学 2013 年 6 月第 25 卷第 6 期 Chin Crit Care Med，June 2013，Vol.25，No.6 ·论著· 流感病毒性肺炎小鼠自然杀伤细胞毒性相关 信号转导通路差异基因表达及两种不同治法 中药方剂的调控作用研究 卢娜娜 刘琪 顾立刚 【摘要】 目的 周旭澎 吴王君 邱泽计 张洪春 晁恩祥 张沂 观察疏风宣肺方和解表清里方对流感病毒性肺炎小鼠自然杀伤细胞（NK 细胞）毒性相关 信号转导通路差异基因表达的调控作用。 方法 将 90 只 ICR 小鼠按随机数字表法分为对照（N）组、模型（M） 组、奥司他韦（C）组以及中药疏风宣肺方高、中、低剂量（SH、SM、SL）组和解表清里方高、中、低剂量（JH、JM、JL） 组，每组 10 只。 采用流感病毒亚甲型鼠肺适应株 FM1 滴鼻感染方法制备流感病毒性肺炎模型；N 组以 0.05 ml 等渗盐水滴鼻。 于制模后 2 h，C 组给予奥司他韦 11.375 mg·kg-1·d-1 灌胃；SH、SM、SL 组给予疏风宣肺方（主要 药物金银花、连翘、板蓝根等）3.76、1.88、0.94 g·kg-1·d-1 灌胃；JH、JM、JL 组给予解表清里方（主要药物麻黄、石 膏、生甘草等）4.36、2.18、1.09 g·kg-1·d-1 灌胃；N 组及 M 组则灌胃等量生理盐水；各组均 0.2 ml/d，连用 4 d。 提取 肺组织总 RNA，采用基因芯片筛选出 NK 细胞毒性信号转导通路相关的差异表达基因，以 I 表示信号强度；并 采用荧光定量聚合酶链反应（PCR）和蛋白质免疫印迹试验（Western blotting）对部分基因进行验证。 结果 在 NK 细胞毒性相关信号转导通路中，M 组较 N 组上调差异基因 43 个。 用药治疗后，SM 组下调差异表达基因 36 个，JM 组下调差异表达基因 29 个，SL 组下调差异表达基因 22 个，JH 组下调差异表达基因 21 个，SH 组下调差 异表达基因 20 个，JL 组下调差异表达基因 10 个；SH、SL、JH、JM、JL 组表达下调的基因均包括在 SM 组的表达 谱中，表明中剂量疏风宣肺方调控 NK 细胞毒性作用最显著。 荧光定量 PCR 和 Western blotting 测定结果显示， 与 M 组比较，疏风宣肺方与解表清里方各剂量组对肿瘤坏死因子 -α（TNF-α）的 mRNA 及蛋白表达均有显著 抑制作用，疏风宣肺方和解表清里方均以中剂量组最低（TNF-αmRNA：1.07±0.19、1.19±0.14 比 3.20±0.56， 均 P＜0.01）。 结论 流感病毒感染后在宿主细胞内增殖即成为带有病毒抗原的靶细胞，并激活 NK 细胞毒性信 号转导通路的相关基因表达增加，被 NK 细胞识别并杀伤；两种方药可下调 NK 细胞中表达上调的差异基因， 下调机制与其能明确减少流感病毒性肺炎体内靶抗原、减弱 NK 细胞识别活化作用有关。 【关键词】 流感病毒性肺炎； 疏风宣肺方； 解表清里方； 自然杀伤细胞； 基因芯片； 小鼠 Screening for genes associated with natural killer cell mediated cytotoxicity in pneumonia mice infected with influenza virus and regulation of two herbal anti-virus formulas LU Na-na*， LIU Qi， GU Li-gang， ZHOU Xu -peng， WU Jun， QIU Ze -ji， ZHANG Hong -chun， CHAO En -xiang， ZHANG Yi. * Laboratory of Chinese Medicine on Viral Disease， Beijing University of Chinese Medicine， Basic Medical College， Beijing 100029， China Corresponding author： GU Li-gang， Email： lggulg@163.com 【Abstract 】 Objective To investigate the regulation of two herbal anti-virus formulas on gene expression profile associated with natural killer cell （NK cell） mediated cytotoxicity in pneumonia mice infected with influenza virus. Methods According to random number table， 90 ICR mice were divided into nine groups with 10 mice in each group： normal group （N）， model group （M）， oseltamivir group （control group， C）， low-dose， medium-dose and high-dose Shufeng Xuanfei formula groups（SL， SM， SH groups）， and low-dose， medium-dose and high-dose Jiebiao Qingli formula groups （JL， JM， JH groups）. The model of pneumonia was reproduced by nasal dropping influenza virus A （FM1） in mice. N group was given isotonic saline 0.05 ml in nasal drops. After 2 hours of model-building， C group was received 11.375 mg·kg-1·d-1 oseltamivir phosphate. Shufeng Xuanfei formula （mainly honeysuckle， forsythia and radix isatidis， etc.） with 3.76， 1.88 and 0.94 g·kg-1·d-1 were administrated to SH， SM and SL groups by gastric irrigation respectively. Jiebiao Qingli formula （mainly ephedra， gypsum， glycyrrhiza glabra， etc.） with 4.36， 2.18 and 1.09 g·kg-1·d-1 were administrated to JH， JM and JL groups by gastric irrigation respectively. In N and M groups， normal saline was administrated with gastric perfusion. Each group was in equal dose of 0.2 ml daily over a 4-day period. Total RNA in lung tissue of mice were extracted in each group， then gene chips were used to screen these RNA samples. DOI：10.3760/cma.j.issn.2095-4352.2013.06.002 基金项目：国家自然科学基金（81173371） 作者单位：100029 北京中医药大学基础医学院中医药抗病毒重点实验室（卢娜娜、刘琪、顾立刚、周旭澎、吴珺、邱泽计、 张沂）；北京中日友好医院（张洪春、晁恩祥）；山西中医学院（刘琪） 通信作者：顾立刚，Email：lggulg@163.com 中华危重病急救医学 2013 年 6 月第 25 卷第 6 期 Chin Crit Care Med，June 2013，Vol.25，No.6 · 323 · Some genes involved NK cell mediated cytotoxicity were select， with "I" representing of signal intensity. These candidate genes were verified by real-time fluorescent quantitation polymerase chain reaction （PCR） and Western blotting． Results In the pathway of NK cell mediated cytotoxicity， M group up-regulated 43 genes expression， and 36， 29， 22， 21， 20 and 10 genes showed down-regulation in SM， JM， SL， JH， SH and JL groups， respectively. Apart from gene co-expression network in SH， SL， JH， JM and JL， SM also expressed other differential genes which SH， SL， JH， JM and JL did not. So medium-does Shufeng Xuanfei formula had the most significant regulation in gene expression of NK cell mediated cytotoxicity. By real-time PCR and Western blotting experiments showed that compared with the M group， mRNA and protein expression of tumor necrosis factor-α （TNF-α） in these two formula groups were significantly down-regulated，