HPLC—ELSD 在中药分析及指纹图谱中的应用

HPLC—ELSD 在中药分析及指纹图谱中的应用内容摘要：

药学实践杂志 　2009 年第 27 卷第 4 期 251 HPLC2ELSD 在中药分析及指纹图谱中的应用 陈 　俊 ,黄玉凤 ,王 　彬 (第二军医大学东方肝胆外科医院药材科 ,上海 200438 ) 摘要 　目的 : 综述高效液相色谱 /蒸发光散射检测器 ( HPLC 2ELSD ) 在中药成分分析和指纹图谱中的应用 。 方法 : 介绍蒸发光散射检测器 ( ELSD )的构造 ,特点和工作原理 。根据中药化学成分的特点 ,对没有紫外吸收 或最大吸收波长在 200nm 以下的天然化合物皂苷类 、 糖类 、 生物碱类 、 内酯类 、 萜类等成分和氨基酸进行分 析总结 。结果 : HPLC 2ELSD 在中药成分分析中起重要作用 。结论 : HPLC 2ELSD 在中药成分分析中应用广 泛 ,是一种非常有用的分析技术 。 关键词 　HPLC 2ELSD; 蒸发光散射检测器 ; 中草药 ; 指纹图谱 中图分类号 : R917 　　　文献标识码 : A 　　　文章编号 : 1006 - 0111 ( 2009 ) 04 - 0251 - 04 　　高效液相色谱仪日益普及 , 所分析的样品范围 散射检测器 ( ELSD )由 3 部分组成 。即雾化器 ,加热 也越来越广 。高效液相色谱以其灵敏 、 快捷 、 可分离 大多数液体样品等优点 , 已经广泛应用于中药的有 效成分含量测定 、 组分分析 、 指纹图谱等方面 , 高效 液相色谱检测器中除了最常用的紫外检测器之外 , 还有荧光检测器 ,示差折光检测器 ,蒸发光散射检测 漂移管和光散射池 。雾化器与分析柱出口直接相 连 ,柱洗脱液进入雾化器针管 , 在针管的末端 , 洗脱 液和充入的气体 (通常为氮气 ) 混合形成均匀的微 小液滴 ,可通过调节气体和流动相的流速来调节雾 化器产生的液滴的大小 。漂移管的作用在于使气溶 器 ,质谱检测器 ,核磁共振检测器等 。紫外检测器因 其高灵敏度和稳定性 ,在 HPLC 中应用最广泛 ,但它 所能检测的物质必须具有吸收紫外光的生色团 , 而 相应的流动相在检测波长下则应当是无紫外吸收 的 。这一特性一定程度上限制了其能检测的物质范 胶中的易挥发组分挥发 , 流动相中的不挥发成分经 过漂移管进入光散射池 。在光散射池中 , 样品颗粒 [1] 散射光源发出的光被检测器检测产生电信号 。 1. 2 　检测步骤 　① 雾化 : 从色谱柱中洗脱出来的 组分和惰性气体混合 , 产生出包含流动相和样品的 围和一些良好溶剂的使用 。荧光检测器只能检测有 荧光的物质 ,应用范围很小 。示差折光检测器是一 种通用的检测器 ,它是基于色谱柱流出物光折射率 的变化来连续测定样品浓度 。但它对工作环境要求 很苛刻 ,要求恒温 ,恒流速 ,且无法采用梯度洗脱 ,检 测灵敏度也不够高 。质谱检测器和核磁共振检测器 气溶胶 。 ②蒸发 : 作为气溶胶的流动相在通过加热 的漂移管时被蒸发掉 。 ③检测 : 留下来的不挥发性 样品颗粒和流动相蒸气通过一个光散射池 , 暴露在 光照之下 ,用光传感器测定样品的散射光产生电信 [2] 号 ,信号与样品的质量成比例关系 。 1. 3 　影响检测的因素 　①载气气压 、 雾化器的设 因其价格较昂贵 , 普及有一定困难 。蒸发光散射检 测器一定程度上弥补了 HPLC 传统检测器的不足 , 特别是无紫外或紫外末端吸收的大分子有机化合物 的检测 ,显示出极大的优越性 。其响应值不依赖于 样品的光学性质 , 不论它具有何种官能团 。对所有 计、 流动相的组成和流速都将影响雾化过程 。 ②被 分析物的浓度和体积质量等决定了进入光散射池的 气溶胶中的颗粒的直径 。 ③被分析物的折射指数 , 光源发出的光的强度和波长 , 光电倍增管的位置等 将影响散射光强度 。 ④光电倍增管的灵敏度和入射 样品的检测几乎具有相同的响应因子 , 对未知物和 纯度的测定要比 UV 检测更容易更准确 。随着蒸发 光散射检测器技术的不断改进和完善 , 将在中药分 析领域广泛的应用 。 光的强度决定了检测的效率反映为实验者所观测的 [ 3 ～5 ] 峰面积 。 1 　蒸发光散射检测器概况 1. 1 　蒸发光散射检测器组成及工作原理 　蒸发光 作者简介 : 陈俊 ( 1979 2) , 女 , 药师 . Tel: ( 021 ) 81875582, E 2mail: chen2 juntcdj@126. com. 2 　HPLC 2ELSD 在中药分析中的应用 中药的化学成分复杂 , 部分成分不存在紫外吸 收或仅在紫外末端有吸收 。加上色谱分离的困难以 及流动相带来的干扰 , 使用传统的紫外检测器对其 进行定性定量分析十分困难 。 ELSD 在某种程度上 弥补了这方面的不足 ,被广泛的应用于皂苷类成分 、 糖类成分 、 内酯类成分 、 部分生物碱类成分 、 萜类成 252 Joumal of Pharmaceutical Practice Vol. 27 2009 No. 4 分和氨基酸以及其他一些成分的分析 , 取得了满意 [6] 的结果 。 2. 1 　皂苷类成分的分析 　皂苷类成分大多没有紫 外吸收 ,或仅在紫外末端有吸收 ,容易受到试剂的干 扰 ,使用紫外检测法存在一定的不足 。应用高效液 相色谱 2蒸发光散射检测器可以较好的检测皂苷成 分 。应用比较成功的有浙麦冬 、 川麦冬中麦冬皂苷 [7] D 含量测 ,酸枣仁中酸枣仁皂苷 A 及 B 的含量测 [8] [9] 定 ,柴胡中柴胡皂苷 a、d 的含量测定 , 黄芪甲 [ 10 ] [ 11 ] 苷的含量测定 , 天麻中天麻苷含量测定 ,西洋 多种氨基酸类成分 ,赵宇新等对其中含量相对较高的 [ 28 ] 精氨酸采用 HPLC 2ELSD 进行含量测定 ,采用同样 [ 29 ] 方法 ,壬陆黎等对红景天根中氨基酸含量测定 ,方 法简便可行 ,值得进一步推广使用 。 3 　HPLC 2ELSD 在中药指纹图谱研究中的应用 中药指纹图谱的研究 , 目 前应 用比较 多的 是 HPLC 2UV /DAD 系统 。它可以比较全面地反映中药 所含内在化学成分的种类和数量 ,但是 ,中药是一个 复杂作用体系 ,是各种不同成分综合作用于人体的 参中的人参皂苷 和伪人参皂苷 含量测定 , 麦 [ 14 ] 冬中皂苷的含量测定 。 2. 2 　糖类成分的分析 　糖类成分多不存在紫外吸 收 ,以前主要采用分光光度法对这类成分进行定量 分析 ,但只能测定总糖含量 , 灵敏度和准确度较差 。 结果 ,使用 HPLC 2UV /DAD 系统 ,并不能使弱紫外吸 收成分和无紫外吸收成分在指纹图谱中有所体现 。 ELSD 是通用型检测器 , 如果选择适当的色谱条件 和仪器参数 ,在确保其稳定性和精密度的前提下 ,应 用于中药指纹图谱的建立 , 可以全面控制中药中的 近来有许多采用 HPLC 2ELSD 方法对糖类成分进行 分析的报道 ,可以直接进行单糖的测定 ,如云芝糖糖 [ 15 ] 肽中的单糖 , 对四物汤中 D 2果糖 、 D 2葡萄糖和蔗 [ 16 ] 糖含量测定 ,取得了良好的结果 。高效液相色谱 分离 2蒸发光散射检测法测定海藻糖 ,有良好的线性 整体物质群 ,真实反映中药内在的化学成分 ,更符合 于中药指纹图谱的要求 。采用 HPLC 2ELSD 指纹图 谱研究比较成功的有清开灵注射液的研究 , 曹进等 运用 HPLC 2ELSD 建立了复方清开灵注射液的指纹 图谱 ,对其中 7 种有效成分进行了定量测定 ,方法学 [ 12 ] [ 13 ] [ 17, 18 ] 关系 ,也可以用于酒和食品中糖成分的分 [ 19, 20 ] 析 。 2. 3 　生物碱类成分的分析 　利用 HPLC 2ELSD 很好 地测定浙贝母药材中的主要生物碱贝母素甲、 贝母素 [ 21～23 ] 乙 ,用于浙贝母药材的质量控制 。分别以环己 烷 2醋酸乙酯 2二乙胺 ( 6 ζ 4 ζ 1 )和环己烷 2醋酸乙酯 2 二乙胺 ( 6 ζ 4 ζ 0. 12 )为流动相 ,对不同来源的样品进 行含量测定。实现了贝母类药材中 6 种异甾族生物 碱的分离和测定 ,得到了良好的重现性和准确度 。 2. 4 　内酯类成分分析 　有的内酯类化合物不能在 UV 检测器上产生响应 ,使用 ELSD 作为检测手段可 考察结果良好 ; 通过指纹图谱相似度评价软件 , 对 10 批清开灵注射液的 HPLC / ELSD 指纹图谱进行了 相似度计算 , 结果表明 : 10 批样品相似度很好 。该 方法为中药质量控制提供了一种可以同时实现整体 [ 30 ] 定性 、 指标成分定量且简便易行的方法模式 。在 中药中研究比较多 的是 知母 的研 究 , 采 用 HPLC 2 ELSD 方法 ,对知母 70%乙醇提取物进行指纹图谱 研究 ,并通过对照品外标法确定知母皂苷 B 2Ⅱ、 知 母皂苷 B 2Ⅲ、anemarrhe 2nasaponin I a、schidigera 2sap 2 onin 2F2、 知母皂苷 A 2Ⅲ的色谱峰 , 其中前 4 个单体 化合物为首次归属 , 分析结果能够反映不同来源知 以取得较好的效果 。采用该方法可以同时对银杏叶 中和市售银杏制剂中的银杏内酯 A , B , C 以及白果 [ 24, 25 ] 内酯进行了定量分析 。对于穿心莲制剂中的 穿心莲内酯 , 采用 ELSD 作为检测手段能较好地进 [ 26 ] 行定量分析 。 母药材的内在质量差异 , 可为知母药材的质量控制 [ 31 ] 提供有价值的参考 。 2. 5 　萜类成分的分析 　中药中萜类化合物以二萜 和倍半萜常见 ,有的以内脂形式存在 ,其紫外吸收一 般都在较低波长范围内 ,且含有酚性物质干扰测定 , 在升麻萜类成分分析中 , 采用反相高效液相色谱法 [ 27 ] 配合蒸发光检测器 ,取得较好的效果 。 所有的化合物 ,同时也是一种破坏性检测器 ,样品无 法回收 ,对于一些挥发性比较强的成分 ,可能在较高 的温度下会随着流动相挥发成气体状态 , 不适于用 ELSD 检测 。 4. 1 　对 ELSD 检测性能的研究不够全面 　HPLC 2 2. 6 　氨基酸的分析 　此类成分的含量测定多采用氨 ELSD 在中药分析和指纹图谱研究中尚处于起步阶 基酸分析仪或采用衍生化法 ,用氨基酸分析仪测定 , 样品处理较复杂 ; 柱前 、 柱后衍生又易产生误差。采 用 HPLC 2ELSD 方法可以较好的测定板蓝根中的氨基 酸含量。板蓝根一般水煎提取 ,其水溶性成分中含有 段 ,尤其对 ELSD 本身的检测性能在中药成分中的 分析没有进