β-淀粉样肽对小鼠海马神经发生的影响及中药的干预作用

β-淀粉样肽对小鼠海马神经发生的影响及中药的干预作用内容摘要：

・3 9 0 ・ 中国康复理论与实践 2003 年第 9 卷第 7 期 Chin J Rehabil Theory Practice , J uly 2003 ,Vol 9 , No . 7 ・ 专题研究・ β2淀粉样肽对小鼠海马神经发生的影响及中药的干预作用 张孟仁 　左萍萍 　李学坤 　孔令娜 　郭赛珊 [ 摘要 ] 目的 观察 Aβ25235 对痴呆小鼠模型海马神经发生的影响及中药“脑复聪”的干预作用 。方法 脑室内注射 Aβ25235 造成 痴呆模型小鼠 。用 Morris 水迷宫测空间学习记忆功能 ; 同位素配基测受体结合活性 ; BrdU 标记的免疫组化检测神经发生 。结果 模型小鼠的学习记忆功能降低 ( P < 0105) ; 海马 NMDA 受体结合活性显著升高而胆碱能 M 受体结合活性显著降低 ( P < 01001) ; 海 马齿状回 BrdU 阳性细胞减少 ( P < 0105) 。经“脑复聪” 治疗后上述变化均得到改善 ( P < 0105 , P < 01001 , P < 0105 ) 。结论 Aβ25235 的神经毒机理包括对神经发生的抑制作用 ; 提高神经发生率可能是中药治疗神经退行性疾病的重要机理之一 。 [ 关键词 ] β2淀粉样肽 ; 神经发生 ; 海马 ; 中药 Effects of β2Amyloid peptide on neurogenesis in brain hippocampus of mice and interfering effect of traditional Chinese medicin2 ZHA N G Men2ren , ZU O Pi ng2pi ng , L I X ue2kun , et al . e Instit ute of B asic Medical Sciences , Beiji ng U nion Hospital , Beiji ng 100005 , Chi na [ Abstract ] Objective To observe t he changes of neurogenesis in t he hippocampus of Alzheimer’ s model mice and t he effect of tradi2 tional Chinese medicine Nao Fu Cong. Methods Alzheimer’ s type dementia of mice was induced by Aβ25235 icv. Space learning and memorial ability were tested wit h Morris Water Maze. The activity of NMDA and M receptor were measured wit h radio2ligand of [ H]M K2801 and 3 [ H]QNB. Neurogenesis was observed wit h t he BrdU immunohitochemistry. Results Space learning and memorial ability significantly de2 3 3 3 creased ( P < 0105) ,[ H]M K2801 binding increased and [ H]QNB binding decreased ( P < 01001 ) ,BrdU positive cells decreased in hipp2 ocampus ( P < 0105) . After given drugs for 2 weeks ,t he mentioned changes were improved significantly ( P < 0105 , P < 01001 , P < 0105) . Conclusions The toxic effect of Aβ25 —35 was involved wit h t he inhibitory action of neurogenesis. Promoting t he neurogenesis may be one of t he mechanism of traditional Chinese medicine to treat t he neurodegenerative diseases. [ Key words] β2Amyloid peptide ;neurogenesis ;hippocampus ;traditional Chinese medicine 中图分类号 : R743. 9 ,R277. 7 文献标识码 :A 文章编号 :100629771 ( 2003) 0720390203 近年发现 ,成年哺乳类动物的神经干细胞通过增 殖、 分化产生新的神经细胞 ,这些新生的神经细胞能够 整合到脑内已有的神经回路建立突触联结 , 参与脑功 [1] [2] 能的修复与重建 。在衰老 或某些神经退行性病变 [3] 动物模型 中神经发生出现异常 ,移植神经干细胞后 , [4] 其受损的学习记忆功能得到明显改善 。因此 , 有学 [5] 者推测 ,神经退行性疾患与脑内神经发生不足有关 。 Alzheimer 病 ( AD) 是一种常见的老年痴呆症 β , 2淀 粉样肽 ( Aβ) 作为 AD 的原发性损害或核心因素已得到 [6] 公认 。Aβ的活性片段 Aβ25235 具有很强的神经毒性 。 本研究拟观察 Aβ25235 对痴呆小鼠模型海马神经发生的 影响及中药“脑复聪” 的干预作用 。 1 材料与方法 1. 1 动物分组及中药治疗 　雄性 BALBΠC 小鼠 , 体重 18 —20g ,由中国医学科学院动物研究所提供 。随机分 为对照 、 模型 、 给药组 ,均自由摄食饮水 。中药方剂“脑 复聪”由人参 、 丹参 、 何首乌 、 水蛭等 7 味中药组成 , 由 作者单位 : 1. 100730 北京市 , 北京协和医院中医科 ( 张孟仁 、 郭赛 珊) ;2. 100005 北京市 , 中国协和医科大学基础医学院药理系 ( 左萍萍 、 李学坤 、 孔令娜) 。作者简介 : 张孟仁 (19632) ,男 ,山西大同市人 , 副主任 医师 ,副教授 ,主要研究方向 : 脑血管病 、 糖尿病 。 中国中医研究院中药研究所经水煮醇提成颗粒 , 配制 成水溶液 , 生药含量 0186gΠml 。给药组按照 1168gΠkg 剂量连续灌胃 7 天 , 于第 8 天脑室内注射 Aβ25235 造模 后 ,再继续同剂量给药 7 天 。模型组造模后不给药物 。 对照组给予等容积蒸馏水 。 1. 2 模型制作 　用灭菌生理盐水配制 Aβ25235 ( Sigma 产品 ) 溶液 , 浓度 3mmolΠL ,37 ℃孵育 72h 使其呈凝聚 [1] 态 。参照 Laursen 和 Belknap 的方法 ,016 %戊巴比妥 钠麻醉 ,75 %酒精消毒后在小鼠右侧脑室定位 ( A : 2mm ;L :2mm ; H : - 4mm) ,用 10ml 微量注射器在其双 耳前缘连接线中点偏右 1mm 处垂直注入 Aβ25235 3ml , 或等量生理盐水 ( 对照组) ,针头原位保留 1min 后缓慢 4 拔针 。术后连续肌注青霉素 4 ×10 uΠ天 。 1. 3 Morris 水迷宫测试 　圆柱型水池 ( 高 70cm , 直径 80cm) ,内设一站台 ( 直径 8cm) , 上方通过数字摄像机 与计算机相连 。小鼠运动轨迹可被追踪并显示于屏幕 上 。水池中加水 , 高 25cm , 用炭素墨水染成不透明黑 色 ,水温控制在 ( 2210 ±015) ℃,水面高出站台 015cm , 使小鼠看不到站台 。实验采用每次入水点相同 , 每次 训练 2min 的方案 ,以小鼠找到站台的时间为寻台潜伏 期 ,于造模后第 4 天上午和造模后第 5 天上 、 下午各进 行 1 次水迷宫测试 ,取平均值作为小鼠的学习成绩 ; 于 ・391 ・ 中国康复理论与实践 2003 年第 9 卷第 7 期 Chin J Rehabil Theory Practice , J uly 2003 ,Vol 9 , No . 7 造模后第 7 天再进行 1 次测试 ,作为其记忆巩固成绩 。 1. 4 BrdU 注射及样本处理 　分别在 Aβ25235 注射后的 第 4、 7 天腹腔注射 BrdU 50mgΠkg ,连续 3 次 ,间隔 8h 。 于末次注射 24h 后麻醉 , 剪开胸腔 , 暴露心脏 , 从左心 尖处插入灌流针 ,剪开左心耳 ,先用 PBS 灌流 , 待血液 冲洗干净后改用 4 %多聚甲醛 , 取脑 , 置于 4 %多聚甲 醛中 4 ℃过夜 , 然后转入 30 %蔗糖中 ,4 ℃存放 。用冰 冻切片机切取 40μm 脑片 。 1. 5 BrdU 免疫组化染色 　将标本首先进行 DNA 变 性 ,50 % formamideΠ2 ×SSC 65 ℃处理 2h 。倾去液体后 用 2 ×SSC 洗 5min , 2M HCl 37 ℃处理 30min , 013 % H2 O2 处理后 , 用含马血清 ,011 % TritonX2100 的 TBS 37 ℃封闭 30min , 加入鼠抗 BrdU 4 ℃过夜 , TBS 洗 3 次 ,每次 10min ,加入 1 ∶80 稀释的生物素化的马抗小 鼠二抗 ,37 ℃下 2h , TBS 洗 3 次 , 每次 5min , 加入辣根 过氧化酶 ,室温 1h ,DAB 显色 ,室温凉干 ,乙醇 、 二甲苯 透明后 ,中性树胶封片 。显微镜下观察并照相 。 1. 6 阳性细胞计数 　脑切片隔 5 取 1 ,每只动物取 4 — 6 张 ,在 40 倍物镜下计数双侧海马齿状回 ( 包括门区 和颗粒细胞下层) 的 BrdU 阳性细胞 ,并用 CCD 相机照 2 相 。数据以每 mm 阳性细胞数表示增殖细胞的数量 。 1. 7 受体结合活性检测 　小鼠于末次行为测试后断 头取脑 ,分离海马 , 加入 Tris2醋酸缓冲液 10ml ,4 ℃离 心 ( 15000rp m ×20min ) , 洗 涤 3 次 , 将 沉 淀 冻 存 于 - 20 ℃,用时再离心 1 次 ,此即为脑突触粗膜 。NMDA 3 受体检测采用 [ H ] M K2801 ( N ET2972 ,2819CiΠmmol ) , - 4 标记物终浓度为 6157nmolΠL ,