红树植物秋茄幼苗叶片中酚类化合物的动态变化

红树植物秋茄幼苗叶片中酚类化合物的动态变化内容摘要：

doi:10.6043/j.issn.0438-0479.201611065 红树植物秋茄幼苗叶片中酚类化合物的动态变化 黄冠闽 （福建漳江口红树林国家级自然保护区管理局，福建 云霄 363300） 摘要：通过分析红树植物秋茄（Kandelia obovata(Sheue, Liu & Yong)）幼苗叶片酚类化合物 含量和结构动态变化，阐述秋茄体内酚类化合物的分布特征和规律。结果表明：秋茄叶片 从 芽 直 到 第 六 对 叶 ， 总 酚 ((144.73±8.56) mg/g ～ (38.79±2.14) mg/g) 和 可 溶 缩 合 单 宁 ((128.44±12.73) mg/g～(19.87±2.45) mg/g)的含量均呈现先降低后升高的趋势，生理活力强 的第三、四对成熟叶的总酚及可溶缩合单宁含量最低。通过高效液相色谱（ HPLC）分析 不同发育阶段叶片单宁主要降解产物（羟基数量递减的翠雀素、花青素、花葵素）相对含 量，逆向推断单宁结构差别：其中花青素含量最多且相对含量稳定；翠雀素含量从幼嫩组 织到成熟叶片逐渐增加，芽和芽中幼叶含量明显较低；花葵素含量在芽中很高，其他组织 中含量相差不大。由此得出，从芽中幼叶到第六对叶片这一发育过程中单宁结构的羟基数 量不断增加。通过基质辅助激光解吸附飞行时间质谱（MALDI-TOF）对各发育阶段叶片单 宁结构直接进行分析：缩合单宁组分从二聚体到十四聚体广泛分布于芽和叶片，但从第三 对叶片开始，单宁聚合体与糖苷结合，特别是在第五、六对已经开始衰老的叶片中这一现 象更为明显。本研究结果显示了秋茄叶片不同发育阶段酚类化合物含量和结构的变化，为 进一步研究叶片中酚类化合物对于红树植物的生存和适应性提供了理论基础和科学依据。 关键词：秋茄；单宁；动态变化 中图分类号：Q 945 文献标志码：A 植物单宁，是一类广泛存在于植物体内的多酚化合物 [1]，分布于植物的皮、根、叶、 花和果实等组织中。单宁作为一种重要的植物次生代谢物，在维管植物中的含量仅次于纤 维素、半纤维素和木质素，属于天然的有机化合物。单宁作为一种重要次生代谢物，同时 也是重要的生理指标，对于植物自身的发育或环境因子的改变（如盐度、重金属污染物 等）也会作出响应。有研究表明，红树植物秋茄根系单宁含量与盐度存在相关性 [2]。另有 试验证明单宁可与蛋白质分子结合而形成稳定的交叉链，抑制酶的活性，又可与淀粉等结 合，影响昆虫对淀粉等营养物质的取食和消化，是一类有效的化学防御物质 [3-4]。单宁在维 管植物中根据结构的不同可分为水解单宁和缩合单宁 [5]，目前缩合单宁的生态功能和在植 收稿日期：2016-11-30 录用日期：2017-03-11 Email: shmch2006@163.com 物体内的生理功能正得到广泛的关注，其在营养和生理上显得极为重要 [6]。缩合单宁可以 与胞外酶等多种酶复合使酶失活而产生抗菌作用[5]，延缓植物发芽、生长和繁殖[7]，影响家 畜的消化和吸收[8]等。 红树林是分布于热带、亚热带河口、海洋潮间带的木本植物群落，是重要的生物资源， 在河口生态系中占有重要的地位[9]。红树植物秋茄(Kandelia obovata(Sheue, Liu & Yong))是 中国红树林的主要代表种类之一，它以独特的“胎生”方式进行繁殖，是我国境内天然分布 最广且分布纬度最高的红树植物[10]。红树植物单宁含量可以高达植物干重的 20%，是单宁 含量较高的植物种类之一 [11]。红树植物的单宁含量随植物种类的不同而不同，真红树的树 皮的单宁含量通常在 1%～30%之间，有开发利用的价值，但白骨壤除外，其单宁含量仅 0.3%；红树植物单宁的含量与植物种类、树龄、产地、生态环境的关系，以及在植物体内 不同部位的分布规律，都还无系统的分析研究。本研究通过分析红树植物秋茄叶片单宁含 量和结构动态变化，从重要次生代谢物——单宁的角度揭示这种海岸特殊生境中特殊植物的 特殊生命规律，为研究和保护红树林提供科学依据。本文的研究于红树植物体内酚类化合 物的组成和分布的认识是重要的补充，对认识单宁次生代谢产物在红树植物提高自身保护 和生存竞争能力、协调与环境关系的重要角色具有重要意义。 1 材料与方法 1.1 材料和采样 通过野外观测，红树植物秋茄幼苗主茎上叶片具有从顶芽、幼叶、成熟叶到已经变黄 将要凋落的叶片，本研究选择秋茄幼苗主茎上不同发育阶段的叶片作为研究对象。 在福建九龙江河口红树林，选取生长正常且无病虫害、机械损伤等的秋茄幼苗植株 20 株；所选植株主茎有六对叶片，并且第六对叶片呈黄色（最靠近顶芽的为第一对叶片）； 采顶芽和主茎的第一对至第六对叶片；顶芽去掉托叶，将芽中最大的一对幼叶与其他部分 分离；这样，包括第一对至第六对叶，共 8 个样品处理，每个样品重复 3 次。 1.2 方法 1.2.1 单宁的测定 总酚（total phenolics，TP）的测定采用普鲁士蓝法[12]；可溶性缩合单宁（extractable condensed tannins，ECT）和蛋白质结合缩合单宁（protein-bound condensed tannins，PBCT）采用正丁醇-盐酸法[13]。除总酚以单宁酸为标准物外，可溶性缩合单宁和 蛋白质结合缩合单宁的测定均以纯化的秋茄叶片缩合单宁为标准物，具体标准物制备和操 作方法详见 Lin 等（2006）[14]。 1.2.2 高效液相色谱（HPLC）分析 鲜样用丙酮提取液浸提，取浸提液 1mL，按照浸提液：正丁醇-盐酸溶液（95%）为 1.2:5.8（体积比）混合，置于沸水浴中 75 min；冷却后利用分液漏斗洗去盐酸，转移至旋 转蒸发仪（EYELA, 东京理化器械株式会社）下蒸干样品（35℃）；加入 1mL 的 30%的乙 腈溶液（超纯水）溶解瓶中物质；过有机膜（ 22μm），存放在 4℃的条件下等待进行 HPLC 分析（Agilent 1100,安捷伦科技有限公司）。 1.2.3 基质辅助激光解吸附飞行时间（MALD I- TOF）质谱分析 仪器： Bruker Reflex Ⅲ 基质辅助激光解吸附飞行时间质谱仪（德国 Bruker 公司)。 实验条件：氮激光波长 337 nm，激光脉冲宽度 3 ns；在反射模式下，加速电压为 20. 0 kV，反射电压为 23.0 kV；以 AngiotensinⅡ (相对分子质量 1 046.5)，Bombesin (相对分子质 量 1 619. 8)，ACTHclip 18～39 (相对分子质量 2 465.2)和 Somatostatin 28 (相对分子质量 3 147.47)为外标；DHB (10 g/L)为基质，基质和样品(7.5 g/L)以体积比 1:3 混合后取 1.5μL 在 靶上点样；基质和样品溶液均用 Amberlite IRP 64 离子交换树脂进行去离子处理，适当比例 的三氟醋酸铯分别加入到基质/样品溶液中以促进形成单离子加合物( [M +Cs ]+ )。 1.2.4 数据分析 数据初步整理采用 Excel，数据统计分析采用 SPSS for Windows 18.0。 2 结果 2.1 秋茄叶片中酚类化合物含量的变化规律 如图 1 所示：从芽、第一对叶到第六对叶片这一系列发育过程中，单位重量中总酚 ((144.73±8.56) mg/g～(38.79±2.14) mg/g)和可溶缩合单宁((128.44±12.73) mg/g～(19.87±2.45) mg/g)的含量都遵循先减少，然后从第三对叶片开始增加的规律；结合缩合单宁的变化规律 不明显。总酚及可溶缩合单宁含量最高为芽和芽中幼叶，最低的为第三对叶 ((38.79±2.14) mg/g)和第四对叶((19.87±2.45) mg/g）。在叶片由芽发育为成熟叶片的过程中，总酚和可溶 缩合单宁的含量逐渐减少；随着叶片的衰老，总酚和可溶缩合单宁的含量又呈现增加的趋 势。 (b) (a) 图 1 单位重量秋茄叶片中总酚（a）和可溶缩合单宁（b）的含量 Fig 1Change in TP(a) content and ECT(b) per unit of weight at the different developmental stages of K.obovata 如图 2 所示，单叶中总酚和可溶缩合单宁的含量都随着叶片生长增加，总体的增加趋 势可以分为明显的三段：从芽到芽中幼叶这一阶段的发育过程中，单叶中总酚和可溶缩合 单宁的含量急剧增加；从芽中幼叶到第五对叶这一阶段的发育过程中，单叶中总酚和可溶 缩合单宁的含量平稳增加。从第五对叶到第六对叶衰老过程中，单叶中总酚和可溶缩合单 宁的含量再次急剧增加。 (a) (b) 图 2 秋茄叶片总酚（a）和可溶缩合单宁（b）的含量 Fig 2 Change in TP(a) content and ECT(b) at the different developmental stages of K.obovata 2.2 秋茄叶片中单宁化合物不同组分的变化规律 用 7:3 丙酮水溶液提取得到单宁初提物。用正丁醇 /盐酸（95:5）法降解得到花色素类 物质降解产物。通过分析降解产物，逆向推断样品中单宁结构组分的变化规律。单宁的降 解产物主要有三种：翠雀素、花青素、花葵素。三种主要降解产物化学结构的基本结构相 似，只是羟基（-OH）数目的差别：花青素比花葵素多一个羟基；翠雀素多含两个羟基 （图 3(a)）。 (a) (b) 图 3 秋茄叶片单宁主要降解产物的化学结构图（a）和相对含量（b） Fig 3 The chemical structure (a) and relative content (b) ofmain tannins degradation product from K.obovata 如图 3(b)所示：花青素含量最多，其含量比值变化规律稳定；翠雀素含量在芽和芽中 幼叶中的含量明显低于其他处理，从第一对叶片开始其含量明显增高；花葵素含量在芽中 很高，但是到芽中幼叶其含量已经急剧减少，其他处理中含量相差不大。 2.3 MALDI- TOF 质谱分析单宁化合物 Cs+作为离子化试剂的分析条件下，秋茄芽、芽中幼叶、第一对叶片到第六对叶片缩 合单宁的 MALDI-TOF 质谱图中部分离子峰系列见表 1。 表 1 秋茄叶片缩合单宁的 MALDI-TOF 质谱图中部分离子峰系列 Table 1 Molecule-ion intensity of MALDI-TOF analyses of condensed tannins from K.obovata 聚合度 芽 芽中幼