蔬菜中有机磷农药残留的两种酶抑制快速检测方法的比较研究

蔬菜中有机磷农药残留的两种酶抑制快速检测方法的比较研究内容摘要：

维普资讯 http://www.cqvip.com ※分析 检 验　 ２ ０ ０ ３ ，Ｖ ｏ １ ． ２ ４ ， Ｎｏ ．８ 　１ ３ ５　 蔬菜 中有机磷农药残留的两种酶抑制　 快速检测方法的比较研究　 黄 志 勇 ，袁　 园 ， 吕 禹泽　 （ 集美 大 学生 物 工程 学 院 ，厦 门　 ３６１０２１） 　 摘 要 ：本实验 比较 了快速测 定蔬菜 中有机 磷农残 的两 种酶抑制法 即胆碱酯 酶抑 制法和植 物酯酶抑制 法 ，通过 正交　 实验优化 了两种 酶抑 制法 的测 定条件 。对实 际蔬菜样 品的磷 农残测定结果表 明 ：这两种 酶抑制快速测 定方法均可用　 于蔬菜 中有机 磷农残 的测 定 ，其 加标 回收率 都达到 ８５％ 以上 。但 植物 酯酶法 测量精 密度较 好（ ３％ 以下），酶源 易　 得 ，提 取 、保 存 方 便 ，在 有 机磷 的快 速测 定 中有 更广 泛 的应 用 价 值 。 　 关键 词 ：有 机 磷 农 药 残 留 ；快 速 测 定 ： 酶抑 制 法 ；蔬 菜　 Ａｂｓ ｔｒ ａｃｔ： Ｂａ ｓｅｄ ｏｎｔ ｈｅｔ ｏｘｉ ｃｏｌ ｏｇｙｔ ｈｅｏｒ ｙｔ ｈａｔｔ ｈｅｏｒ ｇａ ｎｏｐｈｏｓ ｐｈｏｒ ｒ ｉ ｓｐｅｓ ｔ ｉ ｃ ｉ ｄｅ　 ｃａｌ ｌｉ ｎｈｉ ｂｉ ｔＡＣｈＥ　 ａ ｎｄｐｌ ａｎｔ ￣ｓ ｔ ｅｒ ａｓ ｅ　 ａｃｔ ｉｖｉ ｔ ｙ， 　 ｔ ｗｏ　 ｒ ａｐｉ ｄ　 ｍｅｔ ｈ ｏｄｓ　 ｏｆ　 ｄｅｔ ｅ ｒｍｉ ｎｉ ｎｇ　 ｏｒ ｇａ ｎｐｈｏｓｐｈｏｒ ｕｓ 　 ｅ ｓｔ ｐ ｉｃｉ ｄｅ 　 ｒ ｅｓ ｉ ｄｕｅｓ 　 ｉ ｎ　 ｖｅｇｅｔ ａｂｌ ｅｓ 　 ｂｙ　 ｉ ｎｈｉ ｂｉ ｔ ｉ ｎｇ　 ＡｃｈＥ　 ｏｒ 　 ｐｌ ａｎｔ － ｅｓｔ ｅｒａ ｓｅ　 ａｃｔ ｉｖｉ ｔ ｙ Ｗｅｒ ｅ ｅｓ ｔ ａｂｌ ｉ ｓ ｈｅｄ．Ｒｅｓ ｕｌ ｔ ｓ　 ｓ ｈｏｗｅｄｔ ｈａｔｔ ｈｅ　 ｒ ｅｃｏｖｅｒ ｉ ｅｓｏｆａｄｄｉ ｎｇ　 ｓｔ ａｎｄａｒ ｄｓｂｙｔ ｈ ｅｔ ｗｏｍｅｔ ｈ ｏｄｓＷｅｒ ｅ ｍｏｒ ｅｔ ｈａ ｎ　 ８５％，ｔ ｈ ｅ　 ｅｌ ｒ ａｔ ｉｖｅ　 ｓ ｔ ａ ｎｄａ ｒ ｄｄｅｖｉ ａｔ ｉｏｎｓ　 ＳＤ％）ｗａｓｌ ｓ ｓｔ ｅ ｈａ ｎ３％ ｆ ｏｒｔ ｈ ｅｌ ａｔ ｔ ｅｒ，ａ ｎｄｔ ｈｅｌ ｏｗｅ ｓ ｔｄｅｔ ｅｃｔ ｉｏｎｌ ｉ ｍｉ ｔ ｓ　 ｒａ ｎｇｅｄｆ ｒ ｏｍ ０． ０１ 　 ｔ ｏ０． ６ｍｇ／　 ｋｇｆ ｏｒｔ ｈｅｂｏｔ ｈ ｍｅｔ ｈｏｄｓ．Ｔｈｅ 　 ｒａ ｐｉ ｄｄｅｔ ｅｒ ｍ ｉ ｎｉ ｎｇ ｍｅｔ ｈｏｄｓ　 ｃａ ｌ ｌｂｅｕｓｅｄｆ ｏｒｔ ｈｅｑｕａ ｎｔ ｉｆ ｉｃａｔ ｉｏｎｏｆｏｒ ｇａ ｎｏｐｈｏｓｐｈＯＤＩ Ｓｐ ｅ ｓｔ ｉ ｃｉ ｄｅ　 ｅｓ ｒ ｉ ｄｕｅｓｉ ｎｖｅｇｅｔ ａｂｌ ｅｓ，ｅｓ ｐｅｃｉ ａｌ ｌ ｙｂｙｔ ｈ ｅｐｌ ａｎｔ ￣ｓ ｅｒ ｔ ａｓ ｅ． 　 Ｋ ｅｙ　 ｗｏｒｄｓ：ｏｒ ｇａ ｎ ｏｐｈｏｓ ｐｈｏｍ ｓ　 ｅ ｓｔ ｐ ｉ ｃｉ ｄｅ　 ｅｓ ｒ ｉ ｄｕｅｓ；ｒ ａｐｉ ｄ　 ｄｅｔ ｅｒ ｍｉ ｎａｔ ｉｏｎ； ｉ ｎｈｉｂｉ ｉｎｇ　 ｔ Ａ ＣｈＥ　 ａｎｄ　 ｐｌ ａｎｔ － ｅｓｔ ｅｒ ａｓｅ　 ａｅｔ ｉｖｉｔ ｙ； 　 ｖｅｇｅｔ ａ ｂｌ ｅ　 中图分类 号：ＴＳ２ ０７． ５＋ ３ 　 文献标识码 ：Ａ　 酶抑制法测定农产 品中有机磷 农残 是根 据磷农药的毒性对　 文章编号 ：１ ０ ０２． ６６３ ０（ ２ ００３ ） ０８． ０１ ３５ ． ０３ 　 ０． ５　 ｍｇ／ ｍｌ胆碱酯酶（ ＣＨＥ）：称取胆碱酯酶干粉（ 北京 中生　 酶分解底物 的抑制作用进行 的，其 中使用 的酶主要有动 物酶源　 生物工程高技术 公司） 用超纯水溶解配 制 ；１ ０　 ｍｇ ／ ｍｌ氯化 乙酰　 的胆碱 酯酶和从淀粉 中提取 的植 物酯酶 ［ １ ￣ ， １ 。前者是利 用有机　 胆碱 ：取 １ ｇ氯化 乙酰胆碱（ 上海三 爱思试剂有 限公司） 用超纯水　 磷 农药的毒 性抑制其 分解底 物 乙酰胆 碱 的程 度进行 测定 ： 　 乙酰胆碱 ＋水　 里苎塑堕。 乙酸 ＋胆碱　 溶解 配制 ；１ ． ２５ ｍｇ／ ｍｌ 　 Ｑ一乙酸萘 酯：１ ２ ５ 　 ｎ ａ ｇ　 Ｑ－乙酸萘酯 （ 中　 国医药集 团上海化学试剂 公司） 溶于 １ ００ｍｌ无水 乙醇 中。 　 而后者则是利用植物酯 酶水解底 物乙酸萘酯时受到磷农药　 １ ． ２ 实验材料　 的抑制 进 行 定量 分析 ： 　 ａ一乙酸萘酯 ＋水　 垫塑塑堕。 　 乙酸 ＋萘酚　 由于 酶抑制 法操作 简便 、快 速且适 于现 场检测 及 大批量　 新鲜蔬 菜（ 购 于集 美菜 农 贸市场 ）：将 菜 叶切碎 ，放 入 研　 钵 中 捣 碎 、榨 汁 、 离 心 ，取 上 清 液 为 样 液 。 　 植 物酯酶 ：称取 ２０． ０ｇ面 粉 ，与 １００ｍｌ超 纯水混 合振 荡　 样 品测试 ， 已得到广 泛应用［ ４ ￣ ６ １ 。本实验 比较 了胆碱酯 酶和植　 ３０ｍｉ ｎ（ ２５℃） 后 ，离 心 １０ｍｉ ｎ，过滤 ，所 得滤液 即酶液 ，４＂ Ｃ　 物酯 酶测 定有机 磷农残 的特 点 ，对其 实验 条件进 行优 化 ，并　 冰 箱 保 存 。 　 利用这两种酶抑制法对蔬菜样 品中的磷农残及其降解速率进行　 １． ３ 实验方法　 实 际测量 。 　 取 一 定 量 酶液 于 试 管 中 ，加 入底 物 并 用 水 补 至 一 定 体　 积 ，加 入样 液 ，于 水 浴 中恒温 一 定 时 间 ，测 定溶 液 ｐＨ 值 。 　 １ 　 材料与方法　 用水代替样液进 行空 白实验 ，其 ｐ Ｈ 值即未受抑 制时酶水解底　 物 的最 低值 ｐＨ０。 　 １ ． １ 仪器和试剂　 ｐＨＳ． Ｐ２型 酸度计 ；数显恒 温水 浴锅 等 。 　 敌 敌畏 果 ２ 　 结 果 与 讨 论　 ８０％ 乳 油 ，江 苏梅 兰 化工 股 份有 限公 司 ； 乐　 ４０％ 乳油 ，福建三农集 团股份有 限公司 ；久效 磷　 ３ ４％　 ２ ． １ 　 正交实验法确定酶水解反应条件　 乳油 ，南通江 山农 药化工股份 有限公 司；辛硫磷 武 穴 市 农药 厂 。 　 收稿 日期 ：２００３－０５—２０ 　 作者简介 ：黄志勇 ，男 ，在 读博士 ，副 教授 。 　 ２ ０％乳 油 ， 　 实验 设计 了底物 、酶 和温 度 的正交 实验 Ｌ９ （ ３・ ），通 过极　 差分析 ，确定 酶水解反应 的最佳 条件 ，结果 如表 １表 ２所示 。 　 维普资讯 http://www.cqvip.com １ ３ ６ 　２ ０ ０ ３ ，Ｖ ｏ １ ． ２ ４ ， Ｎｏ ． ８ 　 ※分析检验　 表１ 　 胆碱 酯酶法正交实验表 Ｌ 。（ ３ ・ ） 　 ５． ８　 ５． ６　 ５． ４　 ５． ２　 ５． ０　 毛４ ． ８ 　 ４． ６　 ４． ４　 ４． ２　 ４． ０　 ３． ８　 ０　 ２　 ４　 ６　 ８　 ｌ０　 时 间（ ｎａｎ） 　 （ ａ） 胆碱酯酶　 编 号　 底物（ ｍ１ ） 　 酶（ ｍ１ ） 　 温度（ ℃） 　 水　 毛　５２ 　　 ５　 ５ 　 ５ 　 ５ 　 ４ 　 ４ 　 ８　 ６ 　 ４ 　 Ｏ 　 ８ 　 ６ 　 ＡｐＨ　 ０　 ５　 １０　 １５　 ２０　 ２５　 ３０　 ３５　 时 间（ ｍｉ ｎ） 　 （ ｂ） 植物 醋酶　 图 １ 酶水解 反应 时间 曲线　 由图 １ （ ａ） 可知 ，胆碱酯酶水解 反应 速度快 ， ｐＨ变化在瞬　 间达 到平衡 ，而 植物酯 酶水解 反应 （ ｂ）的速度 慢 ，ｐＨ变 化需　 在２ ５ｒ ａｉ ｎ后才 能达 到平衡 ，且 ｐＨ变化幅度不 如前 者大 。本 实　 验确定此胆碱酯酶和植 物酯酶的水解反应 时间分别为 ５ 　 ｍｉ ｎ和　 ３０ｍ ｉ ｎ。 　 ２ ． ３ 标准工作 曲线　 在 最佳 酶水解 反应条 件下 ， 用两种 酶抑 制法测 定 的四种　 磷农药标准 工作 曲线 ，以 ｐ Ｈ值变化（ ｙ， ｚ ｘ 　 ｐＨ） 和农药浓度（ ｘ， ｍｇ ／ 　 ｋｇ） 表示 ，其结 果如表 ３所 示 。 　 由表 １可知 ，影响胆碱酯酶水解反应 的各 因素 中，温度是　 表 ３ 标准工作 曲线　 主要 影 响因素 ，且温 度越 高反应 越 完全 ，但是温 度 过高会 造　 成胆碱酯 酶失活 。 由极差分析确定胆碱酯酶水解反应 的最佳条　 件 为底 物（ 乙酰胆碱） Ｏ． ６ｍｌ 、酶（ 胆碱酯酶） Ｏ． ３ｍｌ 、温度 ４５℃。 　 对表 ２进行 同样 的分 析 ，结 果表 明：底 物（Ｑ ．乙酸萘 酯） 　 用量对植物 酯酶水 解反应的影 响最大 ，是 影响该反应的主要因　 素 。根据 极差 分析 ，植 物酯 酶水解 反应 的最佳配 比为 ：底 物　 （Ｑ．乙酸萘酯 ） Ｏ． ８ｍｌ 、植物 酯酶 ０． ３ｍｌ、温 度 ４５℃。 　 ２． ２ 酶水 解反应 时间　 两种酶抑制法测定的四种磷农药标准工作曲线的相关系数大　 部分都在 ０． ９ ８以上 ，能满足果蔬 中磷农药残 留的快速测定要求。 　 按正 交实验 的酶 水解 反应最佳 实验条件 ， 对两 种酶水 解　 ２． ４ 实际样品测量　 反应 的速度 进 行测 试 ， 结果 如 图 １所 示 。 　 用建立的两种酶抑制法分别对 农贸市场购 得的新鲜蔬菜进　 维普资讯 http://www.cqvip.com ※分析检 验 晨！ 品 着　 学　 ２０ ０ ３ ，Ｖ ｏ１ ． ２ ４， Ｎｏ ． ８ 　１ ３７ 　 表４ 　 实际蔬 菜样品 中磷农药残 留的酶抑 制法测 量结果　 表 ６ 最低检 出限　 行磷 农残 的测 定 ，并用一 定浓 度的敌敌畏喷洒蔬菜进行加标 回　 种 酶抑 制法 的测量准 确度 相 当 ， 收率 试验 ，结 果列 于表 ４。两种 酶抑 制法 测 定结 果相 当 ，但　 酯 酶提取 、 植 ２ 物 　钡 　 妻　 竺竺　 。 　 ５ 　 磷农残 降解 速率测试　 测 量精 密度都 较好 。但 植物　 保 存方便 ，酶源 易得 ，在有机 磷 的快速测 定 中有　 广泛的应用价值。 　 ． 将 新鲜 蔬菜 用洗洁 精漂 洗 ，再用 水洗