pdf文档 牙鲆胚胎程序化冷冻保存研究

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牙鲆胚胎程序化冷冻保存研究内容摘要:

第 28 卷  第 3 期 2 0 0 7 年 6 月 海  洋  水  产  研  究 MA RIN E FIS H ERIES R ESEA RC H Vol . 28 ,No . 3 J un. ,2007 牙鲆胚胎程序化冷冻保存研究 王春花1 ,2  陈松林1 3  田永胜1  刘本伟1  邓  寒1 ( 1 农业部海洋渔业资源可持续利用重点开放实验室 中国水产科学研究院黄海水产研究所 ,青岛 266071) ( 2 上海水产大学 ,200090) 摘要   以牙鲆胚胎为材料 ,对胚胎程序化冷冻保存的主要环节进行了探讨 ,以优化牙鲆胚胎的程序 化超低温冷冻保存法 。单一抗冻剂的毒性试验表明甲醇 ( Met hanol ) 、 1 ,22丙二醇 ( P G) 的毒性低于其 他抗冻剂的毒性 。混合抗冻剂的毒性试验表明 ,20 %~ 25 %PM 抗冻剂的毒性很低 ,经其平衡处理 的胚胎 ,冷冻至 - 30 ℃,成活率可达 80 %以上 。植冰前采用 2 ℃/ min 的降温速率 ,从植冰后到入液 氮前温度采用 8 ℃/ min 的降温速率效果较好 。入液氮前温度的筛选实验表明 , 入液氮前的温度以 - 45 ℃较好 。利用 20 %PM 和 22 %PM P ,采取优化的降温程序冷冻保存尾芽期的牙鲆胚胎 , 分别 获得 5 枚和 7 枚复活胚胎 ,并全部孵化出膜 。 关键词   牙鲆   胚胎   程序化   冷冻保存 中图分类号  Q65    文献识别码  A    文章编号  100027075 ( 2007) 0320057207 Study on the cryopreservation of Japanese flounder ( Pa r alicht hys olivaceus) embryos by a programmed freezing method WAN G Chun2hua 1 ,2  C H EN So ng2lin1 3  TIAN Yo ng2sheng1 L IU Ben2wei 1  DON G Han1 ( 1 Key Labo ratory Sustainable Utilization of Marine Fisheries , Minist ry of Agricult ure , Yeallow Sea Fisheries Research Institute , Chinese Academy of Fishery Sciences , Qingdao 266071) ( 2 Shanghai Fisheries U niversity , 200090) ABSTRACT   St udy was carried out o n cryop reservatio n of J apanese flo under ( Pa ral icht h ys ol i v aceus ) embryo s , aiming at optimizing t he p rogrammed f reezing met hod. Thro ugh to xicit y test s of cryop rotectant in J apanese flo under embryo s , met hanol ( MeO H ) and p rop ylene glycol ( P G) were fo und to be lower t han ot her cryop rotectant s in to xicit y to embryo s. Furt hermo re , t he mixed cryop rotectant s , viz. 20 %~25 %PM ( P G + MeO H ) , was even weaker in toxicit y , co mpared to single cryop rotectant . In t he cooling p rocess , it was better to adopt 2 ℃/ min as t he velocit y of descending temperat ure before icing , and t hen using 8 ℃/ min. until expo sing to liquid nit rogen , wit h reaching - 45 ℃ being p referable. By using t he optimized descending tem2 perat ure p rocess , 5 embryo s survived in 26 flounder embryo s at tail2bud stage undergoing cryo2 p reservatio n wit h 20 %PM solutio n , and 7 survived in 45 wit h 22 % PM P solutio n. 国家 863 高技术研究与发展项目 (2001AA621100) 和国家自然科学基金项目 (30570259) 共同资助 3 通讯作者 。E2mail : chensl @ysf ri. ac. cn , Tel : (0532) 85844606 收稿日期 :2006201213 ; 接受日期 :2006204212 作者简介 : 王春花 (19792) ,女 ,硕士研究生 ,主要从事海洋生物学和低温生物学研究 。   58 海  洋  水  产  研  究 第 28 卷   KEY WORDS   Pa ralicht h ys oli v aceus   Embryo s   A p rogrammed f reezing met hod    Cryop reservatio n 牙鲆 ( Paral icht h ys ol i v aceus ) 隶属于鲽形目 ( Paleuro nectiformes ) 、 鲆科 ( Bot hidoe ) 、 牙鲆亚科 ( Paralich2 t hyinae) 、 牙鲆属 ( Paral icht h ys) ,牙鲆主要分布于我国以及朝鲜 、 日本 、 俄罗斯远东沿岸海区 ,是我国重要的海 水养殖鱼类 。近年来 ,由于过度捕捞和近亲繁殖 ,其种群数量在逐渐减少 ,优良性状在逐渐退化 。因此对牙鲆 野生种或优良品种进行长期保存 ,以保护鱼类种质资源已变得越来越重要 。而鱼类配子和胚胎的冷冻保存对 鱼类生物多样性 、 种质资源保护 、 遗传育种和水产养殖具有重要的意义和应用价值 。 程序化冷冻保存法是采用较低浓度的抗冻保护液 ,利用程序降温仪 ,按照预先设计的降温程序将种质细胞 所处的环境降至一定温度 ,然后将其投入液氮中长期保存 ,等需要时再以一定的复温程序使细胞复活 ( 李广武  1998) 。目前 ,程序化冷冻保存法在畜牧业生产中已作为一种常规的胚胎冷冻保存方法而被广泛应用 ,但在 鱼类胚胎保存方面 ,由于鱼类胚胎体积大 、 含水量多 、 卵膜通透性差 、 卵黄含量高 ,给鱼类胚胎冷冻保存带来很 大的困难 、 使其研究进展不大 。迄今为止 ,用程序化方法对鱼类胚胎进行超低温冷冻 ( - 196 ℃) 成功的报道不 多 ,主要包括 : Zhang 等 ( 1989) 用程序降温法将鲤鱼胚胎在 - 196 ℃冷冻保存 ,解冻后 16 枚中 4 枚胚胎复活 ,其 中 3 枚孵化出膜 ; 张克俭等 ( 1997) 将泥鳅心跳期胚冷冻到 - 196 ℃,在 16 枚中有 1 枚胚胎复活并孵化出膜 ; 于 过才等 ( 2004) 用程序冷冻保存法 ,在 72 枚鲈鱼胚胎中获得 3 枚复活胚胎 。以上研究虽获得复活胚胎 ,但胚胎 复活率比较低 、 成活时间短 。而有关牙鲆胚胎程序化冷冻保存的研究 ,目前国内外均未见报道 。本文以牙鲆胚 胎为材料 ,对鱼类胚胎程序化冷冻保存进行了深入细致的研究 ,以建立牙鲆胚胎程序化冷冻保存技术 ,为牙鲆 种质资源保存提供技术手段 。 1  实验材料与方法 1. 1  牙鲆胚胎 牙鲆胚胎采用的是自然受精卵 ,待受精卵发育到所需发育阶段 ,取出胚胎进行实验 。 1. 2  实验试剂 利用常见的两类冷冻保护剂 ,包括渗透性冷冻保护剂 : 甲醇 ( Met hanol ) 、 1 ,22丙二醇 ( P G) 、 甘油 ( Gly ) 、 二 甲基甲酰胺 ( DM F) 、 二甲基亚砜 ( DMSO ) ; 非渗透性冷冻保护剂 : 聚乙烯吡咯烷酮 ( PV P ) 、 蔗糖 ( Sucro se ) 。基 础液用 NaCl ( 0. 422 mol/ L ) 、KCl ( 0. 011 mol/ L ) 、 CaCl 2 ・2 H2 O ( 0. 013 mol/ L ) 、 MgCl 2 ( 0. 024 mol/ L ) 、 Na H2 CO3 ( 2. 26 mol/ L ) 配制而成 。洗脱液是用基础液配制而成的 0. 125 mol/ L 蔗糖溶液 。 1. 3  单一抗冻剂的毒性实验 用基础液配制 15 % Met hanol 、 15 % P G、 15 % Gly 、 15 % DM F 、 15 % DMSO ,用这些抗冻剂在室温下处 理胚胎 30~60 min ,后用洗脱液除去抗冻剂 ,培养 ,计算胚胎成活率 。对照采用基础液 。 1. 4  混合抗冻剂的毒性实验 用基础液配制 20 % PM ( 20 % P G + 20 % Met hanol ) 、 20 % FP ( 20 % DM F + 20 % P G) 、 20 % FM ( 20 % DM F + 20 % Met hanol ) 、 20 % SP ( 20 % DMSO + 20 % P G) 、 20 % SM ( 20 % DMSO + 20 % Met hanol ) ,用这 些抗冻剂在室温下处理胚胎 50~120 min ,后用洗脱液除去抗冻剂 ,培养 ,计算胚胎成活率 。对照采用基础液 。 配制 10 % 、 15 % 、 20 % 、 25 % 、 30 % 、 35 % PM ,用这些抗冻剂在室温下平衡胚胎 , 当有约 50 %胚胎上浮 时 ,将上浮胚胎装入麦管 ,以 - 10. 0 ℃/ min 的速度降至 - 30 ℃并保存 10 min ,38 ℃水浴解冻 ,洗脱 , 培养 ; 计 算成活率 。  第 3 期 王春花等 : 牙鲆胚胎程序化冷冻保存研究   59 1. 5  降温速率的筛选实验 1. 5. 1  室温2植冰前 用 20 % PM

本文档由 sddwt2022-04-09 01:44:03上传分享
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