pdf文档 嗜水气单胞菌感染的中华鳖主要器官差减cDNA 文库的构建

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嗜水气单胞菌感染的中华鳖主要器官差减cDNA 文库的构建 第 1 页

嗜水气单胞菌感染的中华鳖主要器官差减cDNA 文库的构建内容摘要:

第 31 卷 第 4 期 水 生 生 物 学 报 Vol. 31, No . 4 2 0 07 年 7 月 ACTA HYDROBIOLOGICA SINICA July , 2 0 0 7 嗜水气单胞菌感染的中华鳖主要器官差减 cDNA 文库的构建 周秀霞 1, 2 黄 容 1, 2 郭琼林 1 ( 1. 中国科学院水生生物研究所, 武汉 430072; 2. 中国科学院研究生院, 北京 100039) 摘要 : 以致病性嗜水气单胞菌( Aeromonas hydrophila) 人工感染的中华鳖 ( Trionyx sinensis ) 肝、脾、肾组织为材 料, 应 用 抑制性差减杂交( SSH) 技术, 构建了嗜水气单胞菌感染组织的差减 cDNA 文库。以中华鳖管家基因 B- actin 作为差减 指标检测该文库差减效率达 210 倍, 表明感染细菌后某些差 异表达基因得到了相应倍数的 富集。将获得 的 cDNA 片 段连 接到 pMD18-T 载体并转化大肠杆菌 DH5A感受态细胞。PCR 阳性检测显示差减片段在 150) 800bp 之间。该 差 减 cDNA 文库的构建为快速分离和鉴 定中华鳖与细菌感染相关的免疫基因及从分子水平探讨中华鳖的病理和抗 感 染免疫机制奠定了基础。 关键词: 中华鳖; 嗜水气单胞菌; 抑制性差减杂交; cDNA 文库 中图分类号: S941 文献标识码 : A 文章编号: 1000-3207( 2007) 04- 0509-07 嗜水气单 胞菌 ( A eromonas hydrophila ) 在自 然 [ 2) 6] 方面 , 而 均未 涉及机 体本 身 ) ) ) 中 华鳖 感染 界中 广泛分 布, 致 病 性菌 株 感染 可 引 起鱼 类、两 后疾病发生的 分子机 制。而近 年来, 中 华鳖 的分 栖类、爬行类、鸟 类和哺乳 类等动物 的败血症 , 人 子生物学研究多集中于应用同源克隆 方法寻找中 [ 1] 亦可感染 而 发 生腹 泻 等 。 嗜 水气 单 胞 菌 也 是 华鳖 系 统 进 化 的 分 子 证 据 或 种 群 分 子 标 记 一种严重危害中华鳖 ( Trionyx sinensis ) 的致病 菌, 等[ 11, 13] ; 或 应 用 SMART PCR 技 术、Megaclone 和 它能导致鳖 的红脖子 、红底板、出 血性肠道 坏死、 Megasort 技术构建中华鳖 cDNA 文库以鉴定中华鳖 穿孔、疖疮、 出 血等 多种 病症 [ 2) 6] , 严重 地 制约 着 与发育相关的基因 [ 14, 15] 。 养鳖业 的 发展。 嗜 水气 单 胞菌 的 胞 外致 病 因 子 机体几乎所有的生命活动过程( 包括病理的变 有毒素、蛋白 酶、载铁体等 , 其中毒素 和蛋白酶 是 化) , 从本质上讲都是基因表达变化的结果。目前分 主要的致 病 因子 [ 7, 21) 24] 。药 物 防治 是 水产 动 物 离并且克隆差异性表达基因已成为功能性基因研究 疾病防治的一种最 简单、最 直接的 方法。 然而 由 的热点。1996 年由 Diatchenco 等 [ 16] 提出的抑制性差 于嗜水气单胞菌对 很多 抗生 素的 耐药性 很高 [ 8] , 减杂交技术( Suppression subtractive hybridizat ion, SSH) [ 9] 中华 鳖的 耐 药性 也 比较 高 , 药 物大 量 使用 后, 现已被广泛应用于分离、 鉴定鱼类、 鸟类和哺乳类动 对水体 和 动 物 都 有 不 良 影 响, 最 终 危 害 人 体 健 物与病毒、 细菌感染等疾病相关免疫基因 [ 20) 康; 控制 鳖病发生的另 一条有 效途 径是应 用疫 苗 爬行类仍未见系统研究在感染或病理状态下基因表 [ 10] 进行免疫防治 24] ,而 , 但亟需 进一步了解 中华鳖免 疫 达变化的报道。本研究 选用致病性嗜 水气单胞菌 机制及其免疫应答规律。 提高机体免疫力是水产动 物疾病防治的 一个 T 4 株感染的中华鳖内脏主要器官 ) ) ) 肝脏、脾脏和 重要途径, 而对机 体本 身免疫 相关因 子的 研究 可 染的中华鳖差异表达基因差减 cDNA 文库, 并试图 为探讨机体免 疫途径 提供 有力的 依据, 为 疫苗 的 通过该差减 cDNA 文库的构建为分离与鉴定中华鳖 研制和使用指示方向。但是对 嗜水气单胞菌 引起 与细菌感染相关的免疫基因、 探讨中华鳖的病理机 的鳖病的研究, 大多集中在病原研究、病理描 述等 制与免疫机制奠定基础。 肾脏为材料, 利用 SSH 技术构建了嗜水气单胞菌感 收稿日期: 2006-09-26; 修订日期: 2007-03-16 基金项目: 国家自然科学基金资助项目( N o. 30070588; No. 30371091) 资助 作者简介: 周秀霞( 1980 ) ) , 女, 河南商丘人; 硕士; 研究方向为水生动物病理学与免疫学。E-mail: zhxx@ ihb. ac. cn 通讯作者: 郭琼林, E-mail: qlguo@ ihb. ac. cn 水 510 1 1. 1 生 生 学 报 嗜水气单 胞菌 T4 株分离自患病 中华 鳖, 由南 京农 业大 学陆 承平教 授惠 赠。实 验小 鼠 ( 昆明种) 体重 20 ) 25g, 10 周龄, 购自湖北省卫生防 疫站动物中心。实验中华鳖体重 50 ) 80g, 取自武汉 多福科技农庄股份有限公司国家龟鳖集约化养殖基 肾脏, 迅速置液氮中。同时取对照组的相同器官组 织。两组肝脏、 脾脏和肾脏分别混合后各取 500 mg 用 Trizol( Invitrogen) 试剂提取总 RNA, PolyA+ RNA 用 生物素标记的寡聚( dT ) 探针和链亲合素包裹的磁珠 纯化 ( PolyATract mRNA Isolat ion system ( Promega) ) , 详细步骤参照试剂盒说明书。 地, 经过适当浓度的高锰酸钾浸泡 3 ) 5min, 暂养一 周, 确认健康无病后进行试验。 112 实验方法 表1 基因 引物 名称 名称 28 e 培养 20h, 灭 菌生 理盐水 洗下菌 体, 平板计 数 Gene Primer name name 8 并稀释到 4 @ 10 cfu/ mL , 取 014mL 腹腔注射实验小 鼠; 从濒死小鼠肝内分离 细菌, 划线接种 LB 平板, 培养后 挑形 态一 致的 优势 单 菌落 接种 RS 培 养。 挑 RS 平板上的淡黄色菌落, 选取嗜水气单 胞菌具 有代 表 性 的 两 个 重 要 毒 力 基 因 气 溶 素 基 因 [ 21] ine- protease gene, ahpA ) 和丝氨酸蛋白酶基因( ser- [ 22, 23] PCR 扩增引物序列 Tab. 1 The primer sequences for PCR amplification T 4 菌 株 于 LB 斜 面 细 菌 复壮 及 人 工感 染 ( aerolysin gene, aerA ) 31 卷 血。选取症状典型的感染组中华鳖, 取肝脏、 脾脏和 材料和方法 材料 物 进 行 PCR 检 测, 两 者 8 均为阳性的菌落, 扩大 培养后以 116 @ 10 cfu/ 只的 感染浓度腹腔 注射实 验组 中华鳖, 对 照组 注射 灭 菌生理盐水。 气溶 素基因 Aerolysin gene( aerA ) 引物序列 ( 5c-3c) Sequence name A1 CCAAGGGGTCTGTGGCGA CA A2 TTTCACCGGTAACAGGATTG 产物长 度( bp) Product lengh 209 丝氨酸 蛋白酶 P1 ATTGGATCCCTGCCTATCGCTTCAGTTCA 911 基因 Serine protease P2 GCTAAGCTTGCATCCGTGCCGTATTCC B- F GTGATGGTGGGAATGGGTC B- R ATGGCTGGGGTGTTGAAGGT gene( ahpA) 中华鳖 人工感 染前后 嗜水 气单胞 菌检测 对感 染 前嗜水气单 胞菌及感 染后从病 鳖肝脏、肾 脏、肠、 肌动 血液及体表等处分 离的培 养物进 行检测 , 包括 菌 Turtle 落形 态特征、革兰 氏 染色、毒 力基 因 检测 和 利 用 从实验组病鳖分离 的培养 物再感 染健康 鳖, 完 成 回归感染实验。 aerA 引物合成参 照文献[ 24] , ahpA 引物合 成 参照文献[ 23] , 引物序列 见表 1, 以提 取的基因 组 DNA 为模 板进行 PCR 扩 增。 基因组 DNA 的提 取 参照文献[ 22] , 稍加改进: 接种 细菌到含 500LL 液 269 蛋白 B- act in gene ( Bactin ) 中华鳖 B-actin 基因片段的扩增 根据海龟( Chelonia mydas, GenBank accession AY373753) 和拟 鳄龟 ( Chelydra serpentina serpentina, accession AF541916) 的 体 LB 培养基的 115mL EP 管中, 28 e 摇床培养 6 ) B-actin 基 因的保守核苷 酸序列设计合 成一对引物 ( 见表 1) , 用于扩增中华鳖的 B -actin 基因片段。 8h; 5000r/ min 离心 10min 收集菌体, 用 TE( pH 810) 洗涤两次, 然后加入 100 ) 200LL 的 TE, 混匀, 沸水 抑制性差减杂交和嗜水气单胞菌感染相关基因 差减 cDNA 文库的构建 差 减 cDNA 文 库 的构 建 浴 10 min。离 心取 上清 直接用 于 PCR 扩增, 现 配 采用 PCR- SelectTM cDNA Subtraction Kit ( Clontech ) , 现用。PCR 反应参数: 94 e 预变性 2 min; 94 e 30 s, 具体 操 作 参 照 说 明 书 进 行。 首 先, 分 别 制 备 肝 脏、脾脏和 肾脏 混 合 组织 的 Driver cDNA 和 Tester 60 e ( aerA ) 或 55 e ( ahpA ) 30 s, 72

本文档由 sddwt2022-04-09 01:43:45上传分享
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