中华鳖病原性维隆气单胞菌的分离及药敏试验

中华鳖病原性维隆气单胞菌的分离及药敏试验内容摘要：

第 34 卷 第5 期 水 生 生 物 学 报 2010 年 9 月 ACTA HYDROBIOLOGICA SINICA Vol. 34, No.5 Sep, 2010 DOI: 10.3724/SP.J.1035.2010.01060 中华鳖病原性维隆气单胞菌的分离及药敏试验 沈文英 1,2 李卫芬 2 高 研2 (1. 绍兴文理学院生命科学学院, 绍兴 312000; 2. 浙江大学动物科学学院饲料研究所, 杭州 310029) ISOLATION AND DRUG SENSITIVITY STUDY OF PATHOGENIC BACTERIA AEROMONAS VERONII FROM SOFT-SHELLED TURTLE, TRIONYX SINENSIS SHEN Wen-Ying1,2, LI Wei-Fen2 and GAO Yan2 (1. College of Life Science, Shaoxing University, Shaoxing 312000, China; 2. Institute of Feed Science, College of Animal Science, Zhejiang University, Hangzhou 310029, China) 关键词: 中华鳖; 维隆气单胞菌; 分离鉴定; 药敏试验 Key words: Trionyx sinensis; Aeromonas veronii; Isolation; Drug sensitivity 中图分类号: S947.1 文献标识码: A 文章编号: 1000-3207(2010)05-1060-05 中华鳖(Trionyx sinensis)是我国主要淡水养殖名优品 溃烂, 斑中间有灰褐色圆形凹陷; 背壳有大量腐皮脱落, 种之一。但随着中华鳖养殖规模的扩大和集约化程度的提 壳上有硬币大小的白色凹斑。剖检病变表现为: 腮腺红 高, 导致鳖病暴发流行, 阻碍了养鳖业的进一步发展。迄 肿、组织糜烂、有出血斑; 打开内腔有异味、肝肿大、质 今为止, 研究发现的鳖病共约 40 余种, 其中以中华鳖疖 地脆化、表面有小出血点; 胃、肠壁出血、内充满黏性 疮穿孔病、腐皮病、白底板病、肠道坏死症及细菌性肝水 液体。 肿病为主要病害 [1,2], 主要由嗜水气单胞菌和温和气单胞 菌感染引起 [3 — 5] 。维隆气单胞菌属于弧菌科气单胞菌属的 一个成员, 具有较强的毒力 [6,7] , 能引起腹泻、肺炎以及伤 健康鳖取自浙江省临平市中华鳖养殖场, 规格为 100—200 g, 在水产基地养殖一周后, 确认健康后用于致 病性实验。 口感染 [8]和自身限制的肠胃炎 [9]。有关维隆气单胞菌在水 鉴别培养基和微量生化管购自杭州天和微生物试剂 生生物上的致病性尚未见报道。浙江省是开展中华鳖工厂 厂, 质 粒 提 取 试 剂 盒 、 割 胶 回 收 试 剂 盒 、 T 4 连 接 酶 、 化养殖较早的地区, 目前约占全国产量的 60%以上。2006 T-Vector 购 自 上海生工生物工程有限公司, 克 隆 宿 主 菌 年 6 月起, 浙江省暴发了大面积的鳖病, 给养殖户造成了 E. coli Top10, 本 实 验 室 保 存 。 严重的经济损失。本研究对发病中华鳖典型病灶、肝脏和 1.2 肺组织进行了病原菌的分离、鉴定及药敏试验, 为有效防 治鳖病提供技术指导。 1 1.1 材料与方法 材 料 实验用患病鳖于 2006 年 6 月取自浙江省临平市中华 病原菌的分离与培养 从患病鳖典型病灶、肝脏和肺组织取样接种到 LB 和 TCBS 培养基上, 30℃培养 18h。结果: LB 平皿上长出 圆形, 边缘整齐的白色半透明状菌落; TCBS 上呈黄色菌 落。挑选单个菌落作纯培养, 分离菌经 30℃ 18h 培养后 作毒力试验和细菌鉴定。 鳖养殖场, 共 3 只。临床症状表现为: 精神沉郁、行动迟 人工感染与动物毒力检测试验 按刘恭植等 [10] 反复法进行。将纯培养菌株于营养琼 缓、反应迟钝; 底板呈白色; 四肢、颈部和裙边等处均有 脂培养基(NA)斜面上活化后(30℃, 18h), 用无菌生理盐 1.3 收稿日期: 2010-03-18; 修订日期: 2010-06-29 基金项目: 浙江省重点科技项目(No. G20060837)资助 作者简介: 沈文英(1970—), 女, 浙江绍兴人; 副教授, 硕士; 主要从事水生经济动物营养和病害防治研究。E-mail: zoology@usx.edu.cn 通讯作者: 李卫芬, E-mail: wfli@zju.edu.cn 5期 水洗下菌苔, 采用比浊法制成 1.0×108 CFU/mL 的菌悬 2 液, 取该培养物对已暂养一周的 100—200 g 左右健康鳖 进行腹腔注射, 对照组注射无菌生理盐水, 剂量均为 0.4 mL/只, 试验组和对照组各注射 5 只, 分别饲养于 28— 30℃的水族箱中, 观察 10d。同上法重复感染。 1.4 病原菌形态分析和生理生化特性鉴定 将纯培养菌株于营养琼脂培养基(NA) 30℃培养 18h, 用等渗的无菌生理盐水洗下菌苔, JEM-1011 型透射电镜 (日本电子)观察病原菌形态。细菌生理生化特性鉴定按照 微量生化管操作说明进行。 1.5 1061 沈文英等: 中华鳖病原性维隆气单胞菌的分离及药敏试验 细菌基因序列的扩增和测序 以细菌 16SrDNA 通用引物 [11](8f: 5′-AGAGTTTGAT- CCTGGCTCAG-3′, 1492r: 5′-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3′)为引物, 全菌裂解法制备的菌液 DNA 为模板, 采 用常规的 PCR 方法进行扩增。PCR 反应体系(50 μL)为: 2.1 结 果 中华鳖毒力感染实验 人工回感中华鳖结果表明, 分离菌株对健康鳖有较 强的致病力, 3d 发病率高达 100%, 发病中华鳖临床症状 和病理变化与自然病例相同, 从病灶和内脏组织均能分 离到接种菌, 感染后 10d 内死亡率达到 100%。对照组鳖 则无异常, 仍健康活泼。 2.2 病原菌的鉴定 细菌的形态鉴定 分离菌株培养 18 h 后形成的菌 落低凸、圆形, 直径 l—2 mm, 边缘光滑湿润, 有刺激性 气味。光镜检测发现分离菌株革兰氏染色为阴性, 短链状 杆菌, 呈单个或成对分布; 电镜观察发现该菌具有一条 明显的鞭毛, 鞭毛长约为菌体长的 2 倍(图 1)。 细菌的生理生化特性 分离菌最佳生长条件是 5 μL 的 10×扩增缓冲液,模板 DNA 1 μL,引物 10 μmol/mL 30℃ 18h, 也能在 37℃ LB 上生长, 在 LB 培养基中浑浊 各 1 μL, 10 μmol/mL dNTP 1 μL, 5 U/μL TaqDNA 聚合酶 均匀, 在半固体培养基中有动力, 此结果与形态观察结 0.5 μL, 超纯水 40.5 μL, 混匀。反应条件: 94 ℃预变性 果相吻合。该菌氧化酶和 v-p 反应阳性, 能产生吲哚, 利 5 min; 94℃ 44s, 52℃ 60s, 72℃ 2 min, 30 个循环; 最后 用葡萄糖、麦芽糖、乳糖等作为碳源和能量来源, 并能产 72℃延伸 5 min。取 PCR 产物 10 μL, 1%琼脂糖凝胶电泳 酸, 具有区别于其他气单胞菌的特征: 赖氨酸脱羧酶阳 检测。用 AxyprepDNA 凝胶回收试剂盒方法回收和纯化 性, 精氨酸双水解酶阴性。该菌大多数生理生化特性与维 PCR 扩增片段。将回收产物克隆到 PUCm-T 载体, CaCl2 隆气单胞菌(Aeromonas veronii)标准菌株一致(表 1)。根据 转化法将连接好的重组质粒转化到 E. coli Top10 感受态细 《常见细菌系统鉴定手册》 [12] 和布坎南等编的《伯杰细 胞, 通过蓝白斑筛选重组子, 采用 PUCm-T 载体引物 M13 F 菌鉴定手册》 [13]鉴定为维隆气单胞菌(A. veronii)。 和 M13 R 鉴定出阳性重组子, 进行序列测定(Invitrogen 细菌 16S rDNA 基因序列测定 分离菌株基因组 经 PCR 扩增获得了预期的 1.5 kb 的特异条带, 挑选阳性 公司)。 药敏性测定 采用药敏纸片琼脂平板扩散法进行。将病原菌纯培 克隆进行测序, 获得了细菌 16S rDNA 基因的部分序列。 养物于肉汤液中(28℃)培养 16h 后, 取 0.2 mL 均匀涂布于 比对, 与维隆气单胞菌(A. veronii)参考菌株(X74684.1 平皿上, 贴上药敏纸片, 设 4 个重复, 于 28—30℃下培养 ATCC 35624T)的 16S rDNA 同源性达 99%, 分离菌株 18—24h 后测量抑菌圈直径。 16S rDNA 基因和维隆气单胞菌参考菌株 16S rDNA 基因 1.6 图1 Fig. 1 测定的序列(登录号为 HM032146)进行 BLAST 同源序列 病原菌形态结构 (×8000) The morphological structure of the pathogenic bacteria strain (×8000) 1062 水 Tab. 1 生 生 物 学 34 卷 报 表 1 病原菌的某些生理生化特征 Some physiologic and biochemical characteristics of the pathogenic bacteria strains 生理生化特征 Characteristics 病原菌 Pathogenic bacterium 维隆气单胞菌 A. veronii 革兰氏染色 Gram stain G− G− 运动性 Mobility + + 葡萄糖氧化发酵 Glucose oxidation/fermentation F F 鸟氨酸脱羧酶 Ornithine decarboxylase − − 氧化酶 Oxidase + + V-P 反应 V-P reaction + + 苯丙氨酸脱氨酶 Phenylalanine deaminase − (+) 赖氨酸脱羧酶 Lysine decarboxylase + + − − 葡萄糖 Glucose (+) + 麦芽糖 Maltose