维生素C 和E 合用对中华鳖幼鳖非特异性免疫功能的影响
维生素C 和E 合用对中华鳖幼鳖非特异性免疫功能的影响内容摘要：
第 28 卷 水 生 生 物 学 报 第4期 2 0 0 4 年 7 月 ACTA HYDROBIOLOGICA Vol. 28, No . 4 SINICA July , 2 0 0 4 维生素 C 和 E 合用对中华鳖幼鳖非特异性免疫功能的影响 周显青 1, 2 牛翠娟 1 孙儒泳 1 ( 1 北京师范大学生命科学学院; 生物多样性与生态工程教育部重点实验室, 北京 100875; 2 首都医科大学实验动物科学部, 北京 100054) 摘要: 本研究旨在探讨维生素 C 和 E 合用对中华鳖幼鳖非特异性免疫功能的影响。实验设 5 组, 5 组饵料中维生素 C 和 E 的添加量依 次 为 0 和 0mg/ kg ( 对 照组 ) ; 250 和 50mg/ kg ( 实 验 250mg/ kg( 实验 组) ; 2500 和 250mg/ kg( 实验 力、 杀菌活力、补体 C3 和 C4。结果表明, 实验 组 ) ; 2500 和 250mg/ kg ( 实 验 组 ) ; 250 和 组) 。喂 食 4 周, 取其血液, 测定中华鳖血细胞的吞噬率、血清溶菌活 组, 血细胞吞噬 率和血清 杀菌活力明 显高于对 照组, 实验 明显高于其他 4 组, 并且维生素 C 和 E 之间有明显的协同作用 。血清溶 菌活力和补体 C3 的含量, 在实验 明显高于对照组, 实验 组明显高于其他 4 组。补体 C4 在实验 组明显 高于对照组, 但实 验 组 组 组间没 有 明显差别, 维生素 C 和 E 间也没有协同作用。 关键词: 中华鳖; 维生素 C; 维生素 E; 吞噬率; 溶菌活力; 杀菌活力; 补体 C3; 补体 C4 中图分类号: Q958 8 文献标识码: A 文章 编号: 1000 3207( 2004) 04 0356 05 维生素 C 和 E 对机体免疫功能影响的研究, 以 然光照。每天下午 6: 00 投食一次, 将饵料加少量水 往多是分别单独进行。二者联合使用的研究报道较 合成面团后投喂, 投饵量以使动物达到饱足并有少 少。维生素 C 和 E 联用, 明显提高了小鼠的胸腺重 量剩余为准。投 饵 2h 后取出剩余 饵料, 并 进行换 量, 并且明显大于仅给予 VE 的小鼠的重量, 但维生 水, 所换水为预先加温至 30 [ 1] 1 的水。所用饲料 素 C 和 E 间没有明显的协同促进作用。 。维生素 为北京佳伟生 物技术有限公司生产的 全价稚鳖饲 C 和 E 单独或联合使用, 均能促进母鸡淋巴细胞的 料, 饲料中除了没有添加维生素 C 和 E 外, 其他其 增殖, 而且二者联合使用增殖反应最强, 但二者之间 营养成分和能值见周显青等[ 4] 。在此条件下驯养 3 没有协同作用 [ 2] 。在鱼类的研究中发现, 维生素 C 和 E 联合使用, 对其白细胞的吞噬作用有协同促进 [ 3] 作用 。关于两栖和爬行动物, 迄今未见维生素 C 周, 使其适应实验室环境条件后再开始实验。 1 2 实验设计 选用 60 只健康的中华鳖幼鳖 ( 体 重范围为 103 4 214g) , 将其随机分成 5 组。每组 和 E 联合使用的研究报 道。鉴于各种营养素 的作 12 只分设两个平行, 分别置于 60 30 40cm 的玻璃 用彼此相互联系, 因此本研究拟探讨维生素 C 和 E 缸中。由于幼鳖外观上难以区分雌雄, 因此本研究 联合添加对中华鳖免疫功能的影响, 对二者间的相 不分性别。5 组动物的饵料除了维生素 C 和 E 的添 互关系进行探讨。 加量不同外, 其他营养成分同驯化时 相同。5 组饵 1 1 1 料中维生素 C 和 E 的添加量见表 1。实验期间饵料 材料与方法 实验动物和驯化 存放在- 20 的冰箱中, 每天喂食前 4h 从冰箱中取 中华鳖( Trionyx sinensis ) 幼 出。其他实验条件的控制与驯化时相同。实验进行 鳖购于北京顺义县天竺甲鱼养殖场, 买回后饲养于 4 周后, 每缸取一半幼鳖断头处死, 收集血液在 4 实验室玻璃缸内。水温控制在 30 条件下离心制备血清, 血清存放在- 20 1 , 光 照为自 收稿日期: 2003 10 10; 修订日期: 2003 11 13 基金项目: 国家自然科学基金资助( 编号: 30271014) 作者简介: 周显青, 女, 山东省诸城市人; 博士, 副教授; 主要从事动物生理生态和营养生理方面的研究 通讯作者: 牛翠娟 冰箱中, 以 4期 周显青等: 维生素 C 和 E 合用对中华鳖幼鳖非特异性免疫功能的影响 357 备下 列 指 标 的 测 定。 另 一 半 中 华 鳖 留 作 应 激 成一 定浓 度 的菌 悬 液 ( O D 研究。 3mL 该悬液与 50 L 待测血清于试管中混匀, 测其在 570nm 处的光密度值( A0 ) , 然后置于 37 水浴保温 表1 饵料中维生素 C 和 E 的添加量 Tab. 1 The supplementation of Vitamin C and E in diet 570 = 0 35 0 5) 。取 30min, 取出后立刻置于冰浴 中 10min 以终 止反应, 测其在 570nm 处的光密度值( A) 。杀菌活力按下式 组别 VE( mg/ kg 饵料) V c( mg/ kg 饵料) 对照组 0 0 组 50 250 1 6 血清补体 C3 和 C4 含量的测定 组 50 2500 生物技术有限公司生产的试剂盒, 分别按要求加入 各试剂及血清后, 在 37 水浴 10min, 用透射比浊法 组 250 250 在 722 型紫外分光光度计 340nm 波长处读取测定管 组 250 2500 和标准管的光密度值( A) , 以计算补体 C3 和 C4 的 计算: 1 3 血细胞吞噬作用的测定 按王安利等 [ 5] 人的 Uk = [ ( A 0- A) / A] 1/ 2 含量。 1 7 数据分析 采用伊利康 采用 STATISTICA 统计软件包中两 方法进行测定。将高效活性干酵母放在 2% 的蔗糖 因素方差分析和 Duncan 多重比较对所得数据进行 水溶液中, 用盐酸调 pH 3 4, 30 分析处理, P < 0 05 即认为有差异显著性。所有的 结果均以平均值 标准差来表示。 水浴 2h, 然后再 煮沸 0 5h 将其杀死。离心除去上清液, 再用无菌生 理盐水洗两次, 除去上清液, 最后将酵母菌用无菌生 理盐水配成浓度为 2 10[ 8] 个/ mL 的悬液。 2 结果 取血 40 L 滴 于 塑 料 凹孔 板 中, 然 后 加 肝 素 20 L, 酵母菌悬液 20 L, 混匀, 放入密封的湿盒内, 2 1 血细胞吞噬率的变化 两因素方差分析表明, 维生素 C 和 E 合用对中 于 37 培养箱中培养 30min。期间每隔 10min 取出 华鳖血细胞的吞噬率有明显影响( P < 0 01) , 并且 凹孔板摇一次, 培养结束后充分摇匀。然后将鳖血 二者 之间有 明显的 协同促 进作 用( F = 4 80, P = 0 04) 。Duncan 多范围检验表明, 组与对照组间没 涂片, 甲醇固定 3min 姬姆萨染色 10min, 在显微镜下 观察计数。计数 100 个血细胞, 记下吞噬酵母菌的 有明显不同( P > 0 05) , 组中华鳖血细胞的 细胞数, 按下列公式计算血细胞吞噬率: 吞噬率明显高于对照组( P < 0 05) , 实验 血细胞吞噬率= 吞噬酵母的血 细胞数/ 100 个 细胞 100% 高于其他 4 组 ( P< 0 05) ( 图 1) 。 1 4 血清溶菌活力的测定 组明显 以溶壁微球菌( Micro coccus lysoleikticus ) 冻干粉为底物, 按照 Hultmark 等 [ 6] [ 7] 和王雷 等 人 的 方法 进 行。将 底 物 用 0 1mol/ L, pH= 6 4的磷 酸钾 盐缓 冲液 配成一 定浓 度 的悬 液 (O D 570 0 3) 。取 3mL 该悬液与 50 L 待测 血清 于试管中混匀, 测定其水浴前在 570nm 处的光密度 值( A0) , 然后将其置于 37 水浴保温 30min, 取出后 立即置冰浴中 10min 以终止反应, 测定其保温后在 570nm 处的光密度值( A) 。溶菌活力 U1 按下列公式 计算: U1= ( A0- A) / A 1 5 血清杀菌活力的测 定 以 副溶血弧菌( Vibro parahaemolyticus ) 为底物, 采用王伟庆等[ 8] 人的方法。 将底物用0 1mol / L , pH = 6 4的磷酸钾盐缓冲液配 图 1 维生素 C 和 E 合用对中华鳖幼鳖血细胞吞噬率的影响 ( 均值 标准差) Fig. 1 Effect of the combinat ion of vitamin C and E on phagocytic rat e of blood cell in juvenile soft shelled turtle ( M SD) 2 2 血清溶菌活力的变化 维生素 C 和 E 合用对血清溶菌活力影响显著( P < 0 05) , 二者之间协同作用明显( F = 4 51, P= 0 045) 。 组血清溶菌活力明显高于对照组( P < 0 05) , 组明显高于其他 4 组( P< 0 05) ( 图 2) 。 水 358 生 生 物 学 报 28 卷 2 5 血清补体 C4 含量的变化 组中华鳖血清补体 C4 含量明显高于对 照组( P< 0 01) , 但 组间没有明显不同( P > 0 05) 。两因素方差分析表明, 维生素 C 和 E 合用对 补体 C4 没有显著影响( P > 0 05) , 二者间没有协同 图 2 维生图素 C 和 E 合用对中华鳖幼鳖血清杀菌活力的影响 作用( F= 0 750, P= 0 395) ( 图 5) 。 ( 均值 标准差) Fig. 2 Effect of the combination of vitamin C and E on serum bactericidal activity in juvenile soft shelled turtle ( M SD) 2 3 血清杀菌活力的变化
