黄沙鳖白底板病病原菌的分离鉴定及6 种毒力基因检测

黄沙鳖白底板病病原菌的分离鉴定及6 种毒力基因检测内容摘要：

第 37 卷 第5 期 水 生 生 物 学 报 2013 年 9 月 ACTA HYDROBIOLOGICA SINICA Vol. 37, No.5 Sep., 2013 doi: 10.7541/2013.108 黄沙鳖白底板病病原菌的分离鉴定及 6 种毒力基因检测 黄 钧1 黄艳华1 禤均成1 胡大胜2 覃丽芬1 罗华平3 滕忠作1 施金谷1 曾桂忠3 彭民毅1 (1. 广西大学动物科学技术学院/广西水生动物病害诊断实验室, 南宁 530005; 2. 广西水产技术推广总站, 南宁 530022; 3. 广西武鸣县渔政监督管理站, 武鸣 530100) 摘要: 用常规方法从患典型白底板病黄沙鳖的心脏、肝脏等处进行细菌的接种分离, 通过人工感染确定分离 菌株的致病性, API 20NE、16S rRNA 基因序列分析进行病原菌鉴定和确定其系统发育地位, K-B 纸片扩散法 进行药敏试验, PCR 检测病原菌的 6 种毒力基因。试验结果, 共分离到 13 株病原菌, 其中嗜水气单胞菌 9 株, 温和气单胞菌 4 株。在 9 株嗜水气单胞菌中, 有 5 株与 Aeromonas hydrophila ATCC 7966 菌株亲源关系最近, 4 株与 Aeromonas hydrophila 北京株 QDC01 的亲源关系最近; 而 4 株温和气单胞菌与 Aeromonas sobria ATCC 43979 的亲源关系最近。药敏试验结果, 仅头孢哌酮对 13 株病原菌都高度敏感, 来源于不同养殖区域的病原 菌药敏结果相差较大。6 种毒力基因的阳性率, Aer、Act 和 ahp 均为 100%, hly 和 Alt 为 92.31%, ahal 为 76.92%; 毒力基因型共有 4 种, 嗜水气单胞菌主要为 hly ＋ Aer ＋ Alt ＋ Act ＋ ahal ＋ ahp ＋ 基因型, 而温和气单胞菌主要为 hly＋ Aer＋ Alt－ Act＋ ahal＋ ahp＋ 基因型, 同时携带 hly 基因的菌株其致病力更强。 关键词: 黄沙鳖; 白底板病; 嗜水气单胞菌; 温和气单胞菌; 毒力基因 中图分类号: S947.1 文献标识码: A 文章编号: 1000-3207(2013)05-0844-11 黄沙鳖(Truogx sinensis)主要分布于广西、广东 性疾病之一。在中华鳖白底板病病原的研究方面国 的西江流域地区, 是西江流域特有的鳖种, 被认为 内已取得了大量有价值的成果 [1—8], 但对黄沙鳖细 是中华鳖(Trionyx sinensis)的地理群, 但其分类地位 菌性疾病病原的研究报告尚少, 童桂香等对黄沙鳖 尚未最终定论。黄沙鳖体色金黄, 裙边宽厚, 肌肉结 温和气单胞菌进行了分离鉴定和药敏试验 [9] 。普遍 实, 营养丰富、肉质鲜美, 历来是宴席上的美味佳肴, 认为, 气单胞菌(Aeromonads) 的致病性是多种毒力 全身均可入药, 具有一定的保健、药用功能。随着 因子共同作用的结果, 这些毒力基因的种类与数量 野生资源的不断减少和市场需求量的不断增大, 黄 在不同来源菌株间存在一定的差异性。针对气单胞菌 沙鳖的养殖规模也在迅速扩大, 2010 年广西桂平市 的毒力基因, 不少国内外学者已进行了深入研究[10—19], 的黄沙鳖获全国地理标志农产品。但最近几年来, 可至今未见有关黄沙鳖源气单胞菌毒基因分布情况 在黄沙鳖养殖业迅猛发展和高密度集约化养殖条件 的研究报道。为此, 作者对广西南宁市和柳州市养 下, 当管理不善时容易引起养殖环境恶化, 导致细 鳖场的黄沙鳖白底板病进行了病原菌的分离鉴定、 菌性疾病暴发流行, 常常造成巨大的经济损失, 细 药敏试验, 并对病原菌的 hly、Ae、Alt、Act、ahal 菌性疾病对广西黄沙鳖养殖业的发展已构成严重威 和 ahp 六种毒力基因进行了检测, 以期为黄沙鳖白 胁, 其中白底板病因其具有传播快、发病率高、死 底板病病原分子流行病学等领域的深入研究及相关 亡惨重等特点, 已成为危害最为严重的黄沙鳖细菌 疫苗的研发提供参考。 收稿日期: 2012-10-08; 修订日期: 2013-05-17 基 金 项 目 : 广 西 自 然 科 学 基 金 项 目 (2011GXNSFA018065); 广 西 水 产 畜 牧 兽 医 局 专 项 项 目 ( 桂 渔 牧 财 [2010]58 号 ; 桂 渔 牧 财 [2011]52号)资助 通 信 作 者 : 黄 钧 (1957— ), 男 , 广 西 南 宁 市 人 ; 学 士 , 教 授 ; 主 要 从 事 水 产 动 物 疾 病 防 治 技 术 的 教 学 和 研 究 工 作 。 E-mail: hj1351@163.com 5期 黄 钧等: 黄沙鳖白底板病病原菌的分离鉴定及 6 种毒力基因检测 845 下体积。扩增条件: 94℃预变性 5min; 94℃变性 30s, 1 材料与方法 1.1 材料 黄沙鳖病样分别采自广西南宁市和柳州市的不 同黄沙鳖养殖场。健康黄沙鳖购自南宁市某养鳖场, 试验前在实验室经 20d 暂养确认健康无病后用于人 工感染试验。 API 20NE 为法国梅里埃公司生产。药敏纸片购 自杭州天和微生物试剂有限公司。pMD18-T 载体质 粒, BamHⅠ、HincⅡ、HindⅢ内切酶购于 TaKara 公 司; 细菌基因组 DNA 提取试剂盒, DNA 凝胶回收试 剂盒均购自北京天根生物公司; 质粒提取试剂盒购 于上海生物工程公司; 氨苄青霉素购于 Solarbio 公 司; 琼脂糖购于上海基因技术有限公司。PCR 扩增 56℃退火 1min, 72℃延伸 2min, 30 个循环; 最后 72℃延伸 10min。PCR 反应结束后以 1.0%琼脂糖凝 胶电泳方法(100V 电压下电泳 35min)进行鉴定, 用 凝胶成像系统观察, 根据出现的电泳条带确定并 记录结果。PCR 产物送上海生物工程公司进行序列 测定。 1.3 人工感染试验 无菌滤液的人工感染试验 在进行细菌分离 的同时, 将病鳖的心、肝、脾、肾等内脏组织匀浆, 以 细菌滤器过滤后得无菌滤液。将无菌滤液涂布于普 通营养琼脂培养基上 37℃培养 24h, 检验无菌滤液 是否无菌。取健康黄沙鳖, 腹腔注射无菌滤液 0.2 mL/ 只, 对照组注射等量的无菌 PBS 液, 试验组和对照 引物由上海生物工程技术公司合成, 用超纯水稀释 组分别在不同水簇箱内进行 15d 的饲养观察, 期间 后20℃保存。 正常管理。若试验组发生死亡现象时, 取刚死和濒 1.2 细菌的分离与鉴定 细菌的分离 死个体再进行一次无菌滤液的人工感染试验。 取发病症状典型的黄沙鳖, 用 75%酒精棉球擦拭体表消毒后解剖, 在无菌条件下 取心脏、肝脏和腹水, 划线接种于普通营养琼脂培 菌液的人工感染 取 37℃恒温培养 18—24h 的试验菌平板培养物, 用无菌 PBS 液洗下菌苔, 制 成菌悬液, 采用参照麦氏比浊管和结合活菌计数的 养基上, 37℃培养 18—24h, 挑选优势菌落进一步纯 方法确定细菌浓度, 腹腔注射, 试验组注射菌悬液, 化, 并转接至营养琼脂斜面上, 4℃保存备用。 对照组注射等量的无菌 PBS 液。注射后分置于不同 细菌的鉴定 细菌基本特征观察: 将分离菌 水族箱中连续进行 15d 的饲养观察。取人工感染濒 株接种到兔血培养基上, 37℃培养 24h 后观察其溶 死个体再进行细菌分离、滤液人工感染和菌液人工 血性。纯培养细菌在普通营养琼脂培养基上扩培, 感染。 37℃培养 18—24h 后进行革兰氏染色观察细菌的形 1.4 态特征。 菌株毒力基因的检测 细菌基因组 DNA 的抽提 API 20NE 鉴定 将菌株接种于 4 mL 根据氧化酶试验结果, 选 的 LB 培养基中, 置 28℃, 200 r/min 振荡培养 16h, 用 API 20NE 细菌鉴定系统及生化鉴定试剂条对分 取 0.8 mL 菌液于 1.5 mL EP 管中, 12000 r/min 离心 离菌株进行鉴定 [20] 。 16S rRNA 基因序列分析 2min 收集菌体。按照“TIANamp Bacterial DNA Kit”试 将菌株接种于 4 mL 的 LB 培养基中, 置 28℃, 200 r/min 振荡培养 16h, 剂盒说明书提取细菌基因组 DNA, 20℃保存备用。 PCR 检测 根据文献, hly[17]、Aer[18]、Alt[21]、 取 0.8 mL 菌液于 1.5 mL EP 管中, 12000 r/min 离心 Act[19] 、ahal[10] 和 ahp[22] 六种毒力基因分别选择一 2min 收集菌体。按照“TIANamp Bacterial DNA Kit” 对特异性引物进行 PCR 扩增, 引物序列及退火温度 试剂盒说明书提取细菌基因组 DNA, 20℃保存备 见表 1。 用。采用细菌通用引物进行 16S rRNA 基因 PCR 扩 反应体系(25 µL)为: 10×PCR 缓冲液 2.5 µL, 10 mmol/L dNTPs 0.5 µL, 25 mmol/L MgCl2 2.5 µL, 25 pmol/L 上下游引物各 1 µL, Taq DNA 聚合酶(5U) 增 : 正 向 引 物 fD1: 5′-AGAGTTTGATCCTGGC TCAG-3′, 反 向 引 物 rp2: 5′-ACGGCTACCTTGTT ACGACTT-3′, 反应体系(25 µL)为: 10×PCR 缓冲液 2.5 µL, 10 mmol/L dNTPs 0.5 µL, 25 mmol/L MgCl2 2.5 µL, 10 μmol/L 上下游引物各 1 µL, Taq DNA 聚 0.3 µL, DNA 模板 3 µL, 用 ddH2O 补足余下体积。PCR 合酶(5U) 0.3 µL, DNA 模板 3 µL, 用 ddH2O 补足余 据出现的电泳条带确定并记录结果。PCR 产物经 1% 反应结束后以 1.0%琼脂糖凝胶电泳方法(100V 电压 下电泳 35min)进行鉴定, 用凝胶成像系统观察, 根 846 水 Tab. 1 生 生 表 1 PCR 反应引物及退火温度 Primers and annealing temperatures for PCR 退火温度 Denatured