三种鳖线粒体DNA 细胞色素b 基因序列的比较分析

三种鳖线粒体DNA 细胞色素b 基因序列的比较分析内容摘要：

第 30 卷 第 4 期 水 生 生 物 学 报 Vol . 3 0 , No . 4 2006年 7 月 ACTA HYDROBIOLOGICA SINICA July , 2 0 0 　 6 三种鳖线粒体 D NA 细胞色素 b 基因序列的比较分析 陈合格 　刘文彬 　李建中 　张轩杰 ( 湖南师范大学生命科学学院 ,长沙 　410081) 摘要 : 对中华鳖 、 砂鳖和山瑞鳖线粒体 DNA 细胞色素 b 基因进行了引物设计 、PCR 扩增 、 序列测定和 PCR2PFLP ( Polymerase chain reaction2restriction fragment length polymorphism) 分析 。研究结果表明中华鳖 、 砂鳖与山瑞鳖线粒体 DNA Cytb 基因的序列全长相同 ,均为 1140bp ,其 A 、 C、 G、 T 含量相似 ,分别为 378 个 (33. 2 %) 、 322 个 (28. 2 %) 、 122 个 (10. 7 %) 、 330 个 318 个 (27. 9 %) 、 373 个 (32. 7 %) 、 324 个 (28. 4 %) 、 124 个 (10. 9 %) 、 319 个 ( 28. 0 %) 、 380 个 (33. 3 %) 、 (28. 9 %) 、 127 个 (11. 1 %) 、 303 个 (26. 7 %) 。同源性及序列差异率分析表明 : 中华鳖与砂鳖 b 基因序列的同源性为 92. 3 % ,中华鳖 、 山瑞鳖的为 85. 0 % , 砂鳖 、 山瑞鳖的为 84. 1 % ; 中华鳖与砂鳖 b 基因核苷酸序列间的差异率为 7. 7 % ,中华鳖 、 山瑞鳖间的序列差异率为 15. 0 % ,砂鳖 、 山瑞鳖间的序列差异率为 15. 9 % ,而中华鳖 、 砂鳖 、 山瑞鳖 各自个体间的序列差异率分别为2. 37 % 、 0. 88 %和 0. 18 % , 种间差异显著 。用内切酶酶切分析其扩增产物 , 结果表 明 : 用内切酶 Nde Ⅰ可准确鉴别砂鳖 ,而用内切酶 Bam H Ⅰ则可准确鉴别山瑞鳖 。内切酶 Nde Ⅰ和 Bam H Ⅰ的联用 分析 ,可使这三种鳖在分子水平都得到明确的鉴定 。从三种鳖线粒体 DNA Cytb 基因核苷酸序列的显著差异和酶 切位点的变化 ,可以进一步证明砂鳖是不同于中华鳖的鳖属一新种 。 关键词 : 中华鳖 ; 砂鳖 ; 山瑞鳖 ; 细胞色素 b ;PCR2RFLP 分析 ; 分子鉴定标记 中图分类号 :Q173 　　文献标识码 :A 　　文章编号 :100023207 (2006) 0420380206 　　中华鳖 ( Pelodiscus sinensis ) 是中国重要的特种经 济动物 ,其隶属于龟鳖目 ( Testudinata) 、 鳖科 ( Triony2 [1 ] ) ( ) chidae 、鳖 属 Pelodiscus 。山 瑞 鳖 ( Palea stein2 dachneri ) 俗称瑞鱼 、 山瑞 ,在国家重点保护野生动物 名录中被列为国家 Ⅱ级保护动物 , 其一般形态与中 华鳖 极 为 相 似 , 隶 属 于 龟 鳖 目 、鳖 科 、山 瑞 鳖 属 ( Palea) 。传统观点认为 ,中国鳖属动物仅有中华鳖 一种 。1991 年 ,周工健等在对湖南省鳖资源进行实 地调查时 ,发现了一种与现有鳖种资料介绍完全不 同的新种 — — —砂鳖 ( Pelodiscus axenaria ) , 又称铁壳 、 灰壳 。其与中华鳖体形较相似 ,但个体较小 ,体重一 般为 100 —300g ,且在外形 、 骨骼 、 繁殖习性和生活习 性 ,以及生化遗传学指标等方面与中华鳖均存在明 显的差异 ,并判定砂鳖为鳖属一新种 [2 ] 。如能从分 子水平进一步予以证实并找到一个准确可靠的鉴别 方法来有效区分中华鳖 、 砂鳖与山瑞鳖 ,对于这 3 个 不同种鳖的种苗区分 、 资源保护及合理开发利用具 有重要意义 。 动物线粒体 DNA ( mtDNA) 呈严格的母性遗传方 式 ,这样 1 个个体就能代表一个母系集团 ,因而只需 少量材料就能反映群体的遗传结构 , 便于进行群体 分析 。随着分子生物学的发展 ,动物线粒体 DNA 上 的细胞色素 b ( cytochrome b , Cytb ) 基因因其进化速 度适中被认为是探讨近缘种间和种内遗传分化程度 的良好指标 ,近年来被广泛应用于两栖类 、 爬行类 、 [3 —5 ] 鱼类等的系统发育 、 种类鉴别等的研究 。本研 究以 中 华 鳖 、砂 鳖 和 山 瑞 鳖 为 研 究 材 料 , 进 行 了 mtDNA Cytb 基因的引物设计 、 PCR 扩增及其序列测 定 ,分析了 3 种鳖线粒体 DNA Cytb 基因核苷酸序列 间的差异及其酶切位点的差异情况 , 为确定它们的 种间遗传关系和分子方法分类提供了实验依据 , 获 得了 3 种鳖的分子鉴定标记 。 1 　材料与方法 111 　材料来源 　中华鳖 12 只取自湖南省中华鳖原 种场 ,5 只购买于新一佳超市 ;17 只野生砂鳖中的 7 收稿日期 :2005210229 ; 修订日期 :2006201214 基金项目 : 农业部《中华鳖标准》( 编号 :19992Q21603161) 项目资助 作者简介 : 陈合格 (1979 —) ,男 ,湖南祁阳人 ,硕士 ,从事水生动物遗传与育种研究 通讯作者 : 张轩杰 ,男 ,教授 ,博导 ,Tel :073128872552 ,E2mail :zh603 @tom. com 4期 陈合格等 : 三种鳖线粒体 DNA 细胞色素 b 基因序列的比较分析 只取自常德市 , 其余 10 只取自郴州市安仁县永乐 江 ;3 只野生山瑞鳖全部取自广西省南宁市 。 112 　引物设计 　参照平鳖 (Dogania subplana ,登录号 NC2002780) 、 海龟 ( Chelonia mydas ,登录号 AB012104) 及锦龟 ( Chrysemys picta , 登录号 AF069423 ) 线粒体 DNA Cytb 基因两侧 tRNA2Glu 、tRNA2Thr 基因序列 , 选取其保守区设计用于扩增 3 种鳖 Cytb 基因的引 物 C2F : GGACTYTAACCAAGACCAATG 和 C2R : TCAA2 TCTTTGGTTTACAAGACC ,由上海生物工程公司 ( San2 gon) 合成 。 113 　基因组 DNA 的提取及线粒体 DNA Cytb 基因的 PCR 扩增 　将中华鳖、 砂鳖和山瑞鳖放血后 ,立 即取新鲜的肝脏进行基因组 DNA 的提取 ,具体操作 参照张辉等[6 ] 的方法稍有改进 ,测定浓度后 4 ℃存放。 dNTP , Tap 酶及反应的 Buffer 和内切酶 Sal Ⅰ、Xbo Ⅰ 均购自北京华美生物工程公司 ( Sino2American Biotech2 nology Company) , PCR 反应的体积为 25μL , 其中 : Taq 酶 1U ;浓度为 1mmol/ L 的 dNTP 5μL ;20mol/ L 的上、 下 游引物各 1. 0μL ;DNA 模板约 100ng 。使用美国 AB 公 　 381 脂糖凝胶 ,5V/ cm 进行电泳分离约 1h ,EB 染色 ,然后 用凝胶成 像 系 统 扫 描 并 保 存 结 果 。在 经 过 PCR2 RFLP 检测的中华鳖 、 砂鳖和山瑞鳖中 , 各选取一只 进行 Cytb 基因的克隆测序 , 以检测 PCR2RFLP 鉴定 标记的可靠性 。 2 　结果 211 　中华鳖 、 砂鳖和山瑞鳖线粒体 D NA Cytb 基因 的 PCR 扩增 　　利用参照平鳖 、 海龟 、 锦龟线粒体 DNA tRNA2 Glu 、 tRNA2Thr 基因相应序列的保守区设计的引物进 行中华鳖 、 砂鳖和山瑞鳖 mtDNA Cytb 全基因的 PCR 扩增 ,得到了高效扩增的清晰的目的条带 ,且空白对 照实验未出现扩增 ( 图 1 ) , 说明利用近缘种动物 mtDNA 的同源性 ,可以设计龟鳖目动物的相应片段 引物 ,且以此方法设计的引物应该具有普遍性 ,从而 为本研究提供了分子基础 。 司的 GeneAmp PCR System2700 PCR 仪进行扩增 ,循环 参数为 :94 ℃预变性 5min , 然后进入如下循环 : 94 ℃ 50s ,52 ℃ 45s ,72 ℃ 1min 20s ,循环 35 次 ,循环结束后 , 72 ℃延 伸 10min , 于 4 ℃保 存。取 5μL PCR 产 物 用 1. 2 %琼脂糖凝胶 ,5V/ cm ,进行电泳检测。 114 　连接 、 转化反应及序列测定 　将割胶纯化后的 PCR 产物分别与 PMD 182T 载体 ( 大连宝生物产品 ) 进行连接 ,连接及转化反应均按 PMD 182T 载体试剂 盒的要求进行 。碱裂解法提纯质粒 , 用 PCR 方法和 Sal Ⅰ、Xbo Ⅰ双酶切法确认片段的正确插入 。挑选 插入正确的克隆送往上海生物工程公司 ( Sangon) 进 行序列测定 。 115 　限制性内切酶酶切位点分析与 PCR2 RFLP 检 测 　基于中华鳖 、 砂鳖和山瑞鳖 Cytb 基因间 的序列差异 , 用 Jellyfish ( version 1. 4) 软件分析三种 鳖的酶切位点差异情况 ,确定 Nde Ⅰ是可用于 PCR2 RFLP 方法鉴别砂鳖的限制性内切酶 , Bam H Ⅰ可被 用来鉴别山瑞鳖 。并通过分析限制性核酸内切酶 Nde Ⅰ、 Bam H Ⅰ的识别位点在各自序列中所处的 图 1 　mtDNA Cytb 基因 PCR 扩增结果 Fig. 1 　PCR amplification results of mitochondrial DNA Cytbgene M :200bp DNA 分子量标准 200bp DNA ladder marker ;1 —2. 中华鳖 Pelodiscus sinensis ; 3 —4. 砂鳖 Pelodiscus axenaria ; 5 —6. 山瑞 鳖 Palea steindachneri ; 7. 空白对照 blank control 212 　三种鳖线粒体 D NA Cytb 基因全序列的测定 及分析 　　经测序中华鳖、 砂鳖和山瑞鳖线粒体 DNA Cytb 基因扩增序列长度相同 ,均为 1253bp ( base pair ,包括 tRNA2Glu 、 tRNA2Thr 基因