中华鳖弗氏柠檬酸杆菌败血症病原分离鉴定与药敏试验
中华鳖弗氏柠檬酸杆菌败血症病原分离鉴定与药敏试验内容摘要：
水 产 科 学 第 27 卷第 1 期 2008 年 1 月 Vol. 27 No. 1 Jan. 2008 F ISHER IES SC IENCE 中华鳖弗氏柠檬酸杆菌败血症病原分离鉴定与药敏试验 林启存 , 朱丽敏 , 李忠全 , 许宝青 , 谢 楠 ( 杭州市农业科学研究院 , 浙江 杭州 310024 ) 摘 要 : 利用常规分离方法对病鳖肝 、 肾、 肠组织进行细菌性病原分离 , 并对所获得的纯培养物进行 V ITEK - 32 鉴定 、 药敏及人工感染试验 。试验结果表明 , 弗氏柠檬酸杆菌是该败血症的一种主要病原 菌 ,它对左旋氧氟沙星 、 庆大霉素等多种药物敏感 。 关键词 : 中华鳖 ; 败血症 ; 药敏试验 ; 弗氏柠檬酸杆菌 中图分类号 : S966. 5 文献标识码 : A 文章编号 : 1003 21111 ( 2008 ) 01 20042 202 目前我国养鳖规模和产量均获得较好的发展 , 1. 3 病原菌的药敏试验 但养殖环境却不容乐观 ,由于病原体孳生 、 蔓延 , 种 药物敏感性试验按常规纸片法进行 , 取纯培养 质退化 、 种苗流通频繁等因素影响 , 鳖病年年发生 , 且新病 、 疑难病不断出现 , 给养鳖生产带来较大的 物均匀涂布于普通营养琼脂平板 , 贴上各种药敏纸 片 (杭州微生物试剂厂 ) , 30 ℃培养 24 h,测定抑菌 损失 。目前国内虽对有关中华鳖 ( T rionyx sinensis) 圈直径 ,并参照 NCCLS的判断标准进行判定 。 疾病防治的研究报道颇多 ,但由于病原研究的滞后 1. 4 病原菌的人工感染试验 及鳖病命名的混乱 [1] ,相同或相似症状而不同病原 人工感染试验用的中华鳖采自周浦某养鳖场 的却命名同一种病较常见 , 如同为出血性败血症 , 未发病温室鳖 ,平均体质量约 150 g,在试验水族玻 有嗜水气单胞菌 ( hyd roph ila ) 气单胞菌 ( A erom onas sobria ) [2] [3] w a rdsiella ew ing and m cw horter) 引起的 , 也有温和 璃缸里暂养 7 d 后 ,选择体表无伤的健康鳖 ,每组 5 、 爱德华氏菌 ( Ed 2 只 , 6 组 ; 然后将上述方法分离纯化的 24 h 培养物 , [4] 等引起的 ,易造成 8 用无菌生理盐水洗下菌苔 , 制成 5. 0 ×10 、5. 0 × 6 4 防治工作中的被动 。 2006 年杭州市下沙某养鳖场 10 、5. 0 ×10 cfu /m l 的菌悬液 , 进行腹腔注射感 发生了出血性败血症 , 其主要症状为病鳖体表完 染 ,剂量 0. 2 m l/只 ,同时设对照组腹腔注射生理盐 水 0. 2 m l/只 。置水族玻璃缸里饲养 7 d, 水温 ( 30 好 ,全身水肿 ,反应迟钝 ,有的浮于水面 ,不肯下水 ; 不摄食 ,可见便血 ; 剖检可见鳃腺发炎充血 ,肝脏肿 大块状充血 ,肠黏膜脱落 ,且肠道充有大量血水 , 肾 脏点状充血 。由于凭经验用药较难治愈 ,笔者对其 进行细菌性病原分离鉴定及药敏试验 ,以期为该病 防治提供科学参考 。 ±2 ) ℃,观察结果 。 2 结果与分析 2. 1 病原的形态 利用营养琼脂平板从病鳖肝 、 肾、 肠处仅观察 1 材料与方法 到一种外观特征一致的单一菌落 — 24 h 培养物特 征均为淡黄色 (血平板中为乳白色 ) 、 湿润圆形略隆 1. 1 典型病鳖的采集与病原菌的分离 起、 边缘整齐 ,直径 1 ～2 mm ,革兰色染色为阴性的 采集下沙某养鳖场患典型败血症病鳖 ,经表面 短杆菌 。 消毒后断头处死 ,于无菌条件下从病鱼的肝 、 肾、 肠 2. 2 培养物生化反应及鉴定结果 处取样 ,营养琼脂平板划线分离 , 30 ℃培养 24 ～48 h,挑取单个菌落纯培养 ,纯化的菌株低温保存备用 。 由肝 、 肾、 肠上分离到的菌落 (暂定为培养物 1、 培养物 2、 培养物 3 ) , 经纯化及相应的操作后 , 上 1. 2 病原菌的鉴定 V ITEK - 32 仪 , 机器显示 , 3 种培养物生理 、 生化特 观察细菌形状 , 革兰氏染色和遇氧化酶变色 性 (表 1 )除枸椽酸 ( C IT) 项有所差别外 , 其他项均 后 ,填充 入 法 国 梅 里 埃 生 物 公 司 生 产 的 相 应 的 相同 , 其 结 果 均 被 测 定 为 99% 弗 氏 柠 檬 酸 杆 菌 V ITEK - 32 鉴定卡上机鉴定 。 ( C itrobacter freund ii) 。 收稿日期 : 2007 - 01 - 24; 修回日期 : 2007 - 04 - 23. 作者简介 : 林启存 ( 1976 - ) ,男 ,工程师 ,研究方向 : 水产养殖动物病害 . © 1994-2009 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net 林启存等 : 中华鳖弗氏柠檬酸杆菌败血症病原分离鉴定与药敏试验 第 1期 表 1 菌株的形态 、 生理 、 生化特性 项目 革兰色染色 细菌形态 氧化酶 (OX I) DP3 尿素 (URE) 麦芽糖 (MLT) 肌醇 ( INO ) 阿拉伯糖 (ARA ) 葡萄糖氧化 (OFG) 枸椽酸 ( C IT) 甘露醇 (MAN ) 福寿昔醇 (ADO ) 葡萄糖发酵 ( GLU ) 阳性生长控制 ( GC) 丙二酸盐 (MAL) 木糖 ( XYL) 香豆酸 ( COU ) 精氨酸 (ARG) 醋硫胺 (ACE) 色氨酸 ( TDA ) 棉子糖 ( RAF) 硫化氢 ( H 2 S) 赖氨酸 (LYS) 七叶树素 ( ESC) 多膝杆菌素 ( PXB ) 山梨醇 ( SOR) ONP 鸟氨酸 (ORN ) PL I 乳糖 (LAC) 蔗塘 ( SUC) 鼠李糖 ( RHA ) 鉴定 8 培养物 1 培养物 2 - - 培养物 3 - 短杆状 短杆状 短杆状 + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + 99%弗氏柠 99%弗氏柠 99%弗氏柠 檬酸杆菌 檬酸杆菌 檬酸杆菌 2. 3 药物敏感性 对分离的菌株 ,利用涂布法测定该菌株对常用 药物的敏感性 , 试验判断标准与结果见表 2。由表 2 可见 , 培养物对复方新诺明 、 四环素耐药 , 对庆大 霉素 、 左旋氧氟沙星 、 丁胺卡那霉素等药物敏感 。 抗菌素名称 庆大霉素 复方新诺明 左旋氧氟沙星 四环素 丁胺卡那霉素 43 表 2 分离菌株对一些药物的敏感性 判断标准 /mm 结果判定 mm 耐药 ( R ) 中介度 (M ) 敏感 ( S) ≤12 13 ～14 ≥15 S ( 23. 1) ≤10 11 ～15 ≥16 R ( 0) ≤13 14 ～16 ≥17 S ( 19. 0) ≤14 15 ～18 ≥19 R ( 0) ≤14 15 ～16 ≥17 S ( 21. 8) 2. 4 致病性 感染试验 ,试验结果见表 3。由表 3 可见 , 5. 0 ×10 6 cfu /m l、5. 0 ×10 cfu /m l组均可致鳖发病并导致部 分死亡 ,解剖发现 ,这 2 个浓度组所有鳖肝脏 、 肾脏 肿大 ,且充血发炎 ,大部分鳖肠道出血 ,与养殖中发 4 病症状基本相同 ,而 5. 0 ×10 cfu /m l和对照组未见 明显的异常症状 ,试验鳖活动 、 摄食较正常 。 菌株 表 3 分离菌株对健康鳖的致病性 不同浓度组的死亡数 试验数 5. 0 ×108 5. 0 ×106 5. 0 ×104 纯培养物 1 对照组 15 5 /5 15 0 /5 3 /5 0 /5 死亡时间 27 h ～7 d 0 h ～7 d 3 小 结 ( 1 )由病原菌的分离和鉴定看 , 弗氏柠檬酸杆 菌是导致该养殖场鳖败血症的主要病原菌 , 且在 6 10 数量级上即可致鳖大部分发病死亡 , 可初步认 为本次分离到的弗氏柠檬酸杆菌不是一种弱毒菌 株。 ( 2 )目前国内对由嗜水气单胞菌 [ 2 ] 、 温和气单 [3] [4] 胞菌 、 爱德华氏菌 等引起的鳖败血症已有一些 研究和报道 ,但对由弗氏柠檬酸杆菌引起的鳖败血 症未见相关报道 ,本研究属首次发现 。 ( 3 )近几年来 , 随着水生动物柠檬酸杆菌疾病 [ 5 27 ] 陆续被发现 , 疾病的危害性已得到进一步的认 识 ,但对其流行条件 、 致病机理等基础研究还较少 , 有待于进一步深入研究 。 参考文献 : [ 1 ] 吴惠仙 . 中华鳖常见细菌病的病原鉴定及药物体外拮 抗比较 [ J ]. 水产科学 , 2004, 23 ( 6 ) : 5 29. [ 2 ] 王贵平 ,周莉 . 鳖嗜水气单胞菌败血症 [ J ]. 水产科技 情报 , 1999, 26 ( 4 ) : 165 2168 . [ 3 ] 耿继宇 . 幼鳖出血性败血症的诊治 [ J ]. 河南水产 , 2000 (3) : 28 229 . [ 4 ] 林禹 ,胡毅军 . 幼鳖爱德华氏菌败血症的诊断和防治 [ J ]. 水产养殖 , 1995 (5) : 5 25. [ 5 ] 李本旺 ,李春枝 , 张邦杰 , 等 . 中华鳖口咽腔溃烂综合 症病原的研究 [ J ]. 水产科技情报 , 2000, 27 ( 5 ) : 210 2 213. [ 6 ] 李华 ,邢殿楼 ,白国福 , 等 . 弗氏柠檬酸杆菌对河蟹致 病性的 研究 [ J ]. 水生生 物学 报 , 2001, 25 ( 3 ) : 217 2 223. [ 7 ] 沈锦玉 ,顾志敏 , 潘晓艺 , 等 . 红螯螯虾弗氏柠檬酸杆 菌病病原的分离与鉴定 [ J ]. 中国水产科学 , 2005, 12 (2) : 197 2200. 对分离到的菌株分别进行不同浓度的健康鳖 Isola tion , D eterm ina tion and An tim icrob ia l Susceptib ility Test of the C itrobac te r freund ii Septicem ia from Sof
