猪链球菌9 型cps9G 基因的克隆与序列分析
猪链球菌9 型cps9G 基因的克隆与序列分析内容摘要：
殘 动物医学进展， ２００９， ３０（ １）： １ ４ ｉ ｃ ｉ ｎｅ Ｐｒ ｏｇ ｒ ｅ ｓ ｓｉ ｎＶｅ ｔ ｅ ｒ ｉ ｎａ ｒ ｙ Ｍｅｄ 檲檲檲檲檲殘 研究论文 檲檲檲檲檲殘 殘 猪链球菌 ９ 型 ｃｐｓ ９Ｇ 基因的克隆与序列分析 付 薇１，２，陈进喜１，覃芳芸２，王常伟１，熊 毅２，陈汉忠１，刘 棋２ （ １．广西大学动物科学技术学院，广西南宁 ５３０００５； ２．广西动物疫病预防控制中心，广西南宁 ５３０００１） ＳＳ９）基因的核酸序列，设计一对引物，采用 ＰＣＲ 方法从确诊为 摘 要：根据 ＧｅｎＢａｎｋ 中猪链球菌 ９ 型（ 猪链球菌的阳性 样品 中 扩增 ｃｐｓ ９Ｇ 基因 片段，将其克 隆 到 ｐＭＤ１８ Ｔ 载 体上，转化 ＤＨ５α 感受 态细 胞，提取 重组质粒 ｐＭＤ１８Ｔ ｃｐｓ ９Ｇ，经 ＰＣＲ 和酶切鉴定后测序，并与 ＧｅｎＢａｎｋ 上 ＳＳ９ 相应序列进行同源性分析。结 果表明，经 ＰＣＲ 扩增，鉴定为 ＳＳ９ 的有 ８ 株。序列分析发现， ８ 株 ＳＳ９ 的 ｃｐｓ ９Ｇ 片 段 的 核 苷 酸 序 列 较 稳 定， 该基因片段长度 均 为 ５６２ｂｐ，彼此 间的 核苷 酸同源 性 达 ９６． ８％ ～９９． ８％ ，亲 缘关 系 密 切；与 ＧｅｎＢａｎｋ 上 已 发表的 ＳＳ９ 参考毒株的同源性介于 ９６． ０％～９８． ６％ 。 ｃｐｓ ９Ｇ 基因；克隆；序列分析；荚膜多糖抗原 关键词：猪链球菌 ９ 型； 中图分类号： Ｑ７８５； Ｓ８５２． ６１１ 文献标识码： Ａ 文章编号： １００７ ５０３８（ ２００９） ０１ ０００１ ０４ 内外已发表文献 ［８，１４］和 ＧｅｎＢａｎｋ 上猪链球菌 ９ 型基 猪链球菌病是现代养猪业中的一种重要传染 病，主要由 兽 疫 链 球 菌、肺 炎 链 球 菌 和 猪 链 球 菌 引 因序列，针对 ＳＳ９ｃｐｓ序 列 合 成 了 一 对 特 异 性 引 物， 起，常会 引 发 猪 脑 膜 炎、关 节 炎、心 内 膜 炎 和 败 血 对广西猪群中分离的猪链球菌毒株 ｃｐｓ ９Ｇ 基因片段 症 ［ １］ 。各 年 龄 段 的 猪 都 可 感 染 此 病，但 多 发 于 ３ 周 龄 ～１２ 周 龄 的 猪，尤 其 是 断 奶 仔 猪 易 感 染 此 病 ［ ２］ 。 不同的分型技 术 被 用 于 鉴 定 不 同 链 球 菌 毒 株，但 大 部分流 行 病 学 的 研 究 基 于 血 清 分 型 ［ ３］ 。猪链球菌 （ 犛 狋 狉 犲狆狋 狅 犮 狅 犮 犮狌 狊狊 狌 犻 狊， ＳＳ）根据 其 荚 膜 多 糖 抗 原（ ｃ ａｐ ， ） 可 分 为 个 血 清 型， 即 ｓｕ ｌ ａ ｒｐｏ ｌ ａ ｃ ｃｈａ ｒ ｉ ｄｅ ｃｐｓ ３５ ｙｓ １ 型 ～３４ 型和 １／２ 型，其 中 引 起 人 和 动 物 发 病 的 血 清型主要 是 １ 型 （ ＳＳ１）、 ２型（ ＳＳ２）、 ７型（ ＳＳ７）和 ９ ［ ４ ５］ 型（ ＳＳ９） 。 在已知的血 清 型 中，不 是 所 有 血 清 型 在 不 同 的 进行了克隆和 测 序，并 与 国 内 外 毒 株 相 应 序 列 进 行 了比较分析，进 一 步 弄 清 广 西 猪 链 球 菌 病 分 子 流 行 病学的基因背 景 信 息，为 猪 链 球 菌 的 诊 断 和 防 治 奠 定基础。 １ 材料与方法 １． １ 培养基 链球菌增菌培养基购自中国 进出口 商品技术 研 究所，马血清购自宝生物工程（大连）有 限公司，鲜血 琼脂平板由实验室配制。 国家都有同等 重 要 的 地 位。其 中 ＳＳ２ 流 行 最 广，包 １． ２ 样品菌株 由广西动物疫病预防控制中 心实验 室分离并 保 括许 多 欧 洲 国 家 ［４，６］；ＳＳ９ 是 继 ＳＳ２ 之 后 的 主 要 流 存的确诊为猪链球菌的阳性样品。 行血清型，主要 流 行 于 澳 大 利 亚、德 国、比 利 时 和 荷 兰 ［４］，而 在 英 国，最 流 行 的 血 清 型 是 ＳＳ１ 和 ［ ］ ＳＳ１４７８ 。由于缺乏 充 足 的 关 于 该 病 的 流 行 病 学 知 识，且缺乏有效疫苗防治和敏感的 诊断 方 法，使 得对 该病的防 控 比 较 困 难 ［９］。 近 年 来， ＳＳ９ 的 流 行 呈 上 升的趋势 ［１０］， ＳＳ９ 感 染 在 我 国 各 省 （市）均 有 不 同 程 度的发生和流行 ［１１］，给 养 猪 业 造 成 了 巨 大 的 经 济 损 失，成为危害我国养猪业发展的疫病之一。 本试验在前期研究工作的基础上 ［１２１３］，根据国 １． ３ 引物 参考 ＧｅｎＢａｎｋ 上 的 序 列，利 用 ＤＮＡ Ｓ ｔ ａ ｒ软 件 设 计 １ 对 引 物：ｃｐｓ ９Ｇ ｆ：５ ′ ＴＧＧＡＡＡＧＣＡＴＣ ｓ ９Ｇ ｒ： ５ ′ ＣＣＡＡＣＡＣＧＴＧ ＣＴＴＧＴＣＡＡＴＣ ３ ′； ｃ ｐ ＣＡＡＧＡＡＣＴＡＧ ３ ′，扩增的 目 的 片 段 长 度 为５６２ｂｐ， 引物由宝生物工程（大连）有限公司合成。 １． ４ 主要试剂 ｄＮＴＰ、Ｅｘ 犜犪狇 酶、蛋 白 酶 Ｋ、ＤＮＡ 标 准 ＤＬ２０００、 ＳＤＳ、饱 和 酚、ｄｄＨ２ Ｏ、限 制 性 内 切 酶 收稿日期： ２００８ １１ ０３ 基金项目：广西科技厅科技攻关项目（ ０８１５００９ ３ ７） 作者简介：付 薇（ １９８２－ ），女，广西桂林人，硕士，主要从事动物疫病防治研究。 通讯作者 动物医学进展 ２００９ 年 第 ３０ 卷 第 １ 期（总第 １８６ 期） ２ （ 犅犪犿 ＨⅠ 和 犎犻 狀ｄ Ⅲ ）、胶 回 收 试 剂 盒、质 粒 抽 提 试 剂盒、 Ｔ 载体等为宝生 物工 程（大连）有 限 公 ｐＭＤ１８ 产物经 １０ｇ／Ｌ 琼 脂 糖 凝 胶 电 泳 后，扩 增 出 ５６２ｂｐ 的目的片段，与预期大小一致（图 １）。 司产品；注射用 氨 苄 西 林 钠 （ Ａｍｐ）购 自 山 东 鲁 抗 医 药股份有限公 司 产 品。 无 水 乙 醇、醋 酸 钠 等 为 广 东 光华化学厂有限公司产品。Ｙｅ ａ ｓ ｔＥｘ ｔ ｒ ａ ｃ ｔ和 Ｔｒ ｙｐ 为 公 司 产 品。 感 受 态 细 胞 由 本 ＤＨ５α ｔ ｏｎｅ ＯＸＯＩＤ 实验室保存。 １． ５ 液体培养 按说明书配制链球菌增菌培养基，高压 灭菌，加 入 １００ ｍＬ／Ｌ 的 马 血 清，分 装，挑 取 分 纯 的 冻 存 菌 ３７ ℃ 培养 ２４ｈ。 １． ６ 模板制备 取细菌液体培养物 １． ／ｍｉ ２ ｍＬ， １２０００ｒ ｎ离心 １ｍｉ ｎ，弃上清，加入 ３００μＬ 的 生 理 盐 水、 １００μＬ 的 １００ｍＬ／Ｌ ＥＤＴＡ 混 匀， ４０ μＬ 的 １００ｇ／Ｌ ＳＤＳ 和 ８μＬ的 蛋 白 酶 Ｋ（ １０ ｍｇ／ｍＬ），混 匀 后 ５２ ℃ 水 浴 ２ｈ，每隔２０ｍｉ ｎ摇 匀 １ 次。 酚 氯 仿 抽 提 ２ 次，加 入 ２． ５ 倍的无水 乙 醇 及 １／１０ 体 积 （上 清 体 积 的 １／１０） 的 ３ ｍｏ ／Ｌ 醋 酸 钠，混 匀，－ ２０ ℃ 静 置 过 夜。 ｌ ／ｍｉ １２０００ｒ ｎ离 心 １５ ｍｉ ｎ。 倒 掉 上 清，用 １ ｍＬ ７５０ｍＬ／Ｌ的 酒 精 洗 涤 两 次。３７ ℃ 烘 干。 加 入 ３０μＬｄｄＨ２Ｏ，立即使用或置 －７０ ℃ 储存备用。 １． ７ ｃｐｓ ９Ｇ 基因的 ＰＣＲ 扩增 反应体 系 总 体 积 ２５ μＬ，内 含 模 板 ２． ０ μＬ，加 Ｍ．ＤＮＡ 标准 ＤＬ２０００； １． ＧＸＷＸ１５； ２． ＧＸＷＸ１０５； ３． ＧＸＷＸ１１５； ４． ＧＸＹＬ１４２； ５． ＧＸＧＧ０１； ６． ＧＸＧＧ９９； ７． ＧＸＬＰ１４３ ３； ８． ＧＸＲＸ１４５； ９．阴性对照 Ｍ． ＤＮＡ Ｍａ ｒ ｋ ｅ ｒＤＬ２０ ０ ０； １．ＧＸＷＸ１ ５； ２．ＧＸＷＸ１ ０ ５； ３． ＧＸＷＸ１ １ ５； ４． ５． ＧＸＧＧ０ １； ６． ＧＸＧＧ９ ９； ７． ＧＸＬＰ１ ４ ３ ３； ８． ＧＸＲＸ１ ４ ５； ９． Ｎｅ ａ ＧＸＹＬ１ ４ ２； ｇ ｔ ｉ ｖ ｅｃ ｏ ｎ ｔ ｒ ｏ ｌ 图 １ ｃｐｓ ９Ｇ 基因 ＰＣＲ 扩增产物 Ｆ ｉ １ ＴｈｅＰＣＲｐ ｒ ｏｄｕｃ ｔ ｓｏ ｆｃｐｓ ９Ｇｇｅｎｅ ｇ． ２． ２ ＰＣＲ 产物的克隆与重组质粒的鉴定 扩增 的 ＰＣＲ 产 物 与 ｐＭＤ１８ Ｔ 载 体 连 接 后，分 别转 化 大 肠 埃 希 菌 ＤＨ５α，提 取 的 质 粒 用 犅犪犿 ＨⅠ 和 犎犻 狀ｄ Ⅲ 进行双酶切鉴定，电 泳 结 果 如 图 ２ 所 示。 ＳＳ９ 的 ｃｐｓ ９Ｇ 的重组质粒经 酶 切 后，可 见 ５６０ｂｐ 和 ２７００ ｂｐ 左 右 的 两 个 片 段，分 别 为 目 的 片 段 和 Ｔ 载体，结果表明这 ８ 株 菌目的基 因 已 经 准 ｐＭＤ１８ 确插入 ｐＭＤ１８ Ｔ 载体中。 ／Ｌ） １０×Ｅｘ犜犪狇 ｂｕ ｆ ｆ ｅ ｒ２． ５ μＬ， ｄＮＴＰ（ ２． ５ ｍｍｏ ｌ ２． ０μＬ，Ｅｘ 犜犪狇 酶 （ ５ Ｕ／μＬ）０．２５ μＬ，ＭｇＣｌ２ （ ／Ｌ） ／μＬ）各 ２５ｍｍｏ ｌ １ μＬ，上、下 游 引 物 （ ２５ ｐｍｏ ｌ ０． ５μＬ，加 ｄｄＨ２ Ｏ 至 ２５ μＬ。ＰＣＲ 扩 增 程 序 为， ９５ ℃ ５ｍｉ ｎ； ９４ ℃ ４５ｓ， ５６ ℃ ４５ｓ， ７２ ℃ ６０ｓ， ３５ 个 循环； ７２ ℃ １０ｍｉ ｎ。反应 结 束 后 取 ＰＣＲ 产 物 ５μＬ 用 １０ｇ／Ｌ 琼脂糖凝胶电泳，置凝胶成 像 系统中 观察 结果。 １． ８ ＰＣＲ 产物的克隆及序列分析 应用胶回收 试 剂 盒 纯 化 ＰＣＲ 产 物，按 ｐＭＤ１８ Ｔ 载体连接试 剂 盒 说 明 书 进 行 连 接，然 后 将 连 接 产 物 转 化 到 ＤＨ５α 感 受 态 细 胞 中，涂 布 于 含 １００μｇ／ｍＬ Ａｍｐ 的 ＬＢ 琼脂平板中， ３７ ℃ 培养 １４ｈ ～１６ｈ，挑取阳性菌落，进 行 酶 切 及 ＰＣＲ 鉴 定 后，将 Ｍ．ＤＮＡ 标准 ＤＬ２０００； １． ＧＸＷＸ１５； ２． ＧＸＷＸ１０５； ３． ＧＸＷＸ１１５； ４． ＧＸＹＬ１４２； ５． ＧＸＧＧ０１； ６． ＧＸＧＧ９９； ７． ＧＸＬＰ１４３ ３； ８．
