甘薯叶绿体rbcL 基因的克隆与序列分析

甘薯叶绿体rbcL 基因的克隆与序列分析内容摘要：

882 植物生理学通讯 第 44 卷 第 5 期，2008 年 10 月 甘薯叶绿体 rbcL 基因的克隆与序列分析 王玉华 1, 吴忠义 2, 贾敬芬 1, 张秀海 2, 黄丛林 2,* 西北大学生命科学学院, 西安 710069; 2 北京市农林科学院北京农业生物技术研究中心, 北京 100097 1 提要: 根据烟草、水稻和菠菜叶绿体的全基因组序列设计引物, 以甘薯的叶绿体基因组DNA为模板, PCR扩增包含甘薯叶 绿体 rbcL 完整基因(GenBank 登录号为 AY942199)在内的一段序列。序列分析表明: 此片段的全长为 1 627 bp, 包括 1 443 bp 的编码区序列在内, 推测编码 480 个氨基酸, 同时构建了此片段的限制性酶切图谱。相似性比较显示, 此基因编码区序 列与烟草、菠菜、小麦、水稻、玉米、矮牵牛、紫花苜蓿、拟南芥、莨菪、葡萄以及甜菜的 rbcL 基因核苷酸的同源性为 85%~98%, 氨基酸的同源性为92%~95%。 关键词: 甘薯; 叶绿体基因; rbcL基因; 序列分析 Cloning and Sequence Analyses of the rbcL Gene from Chloroplast of Sweet Potato [Ipomoea batatas (L.) Lam.] WANG Yu-Hua1, WU Zhong-Yi2, JIA Jing-Fen 1, ZHANG Xiu-Hai2, HUANG Cong-Lin 2,* College of Life Sciences, Northwest University, Xi’an 710069, China; 2Beijing Agro-Biotechnology Research Center, Beijing 1 Academy of Agricultural and Forestry Sciences, Beijing 100097, China Abstract: A pair of primers used in amplifying chloroplast fragment of sweet potato was designed according to the corresponding sequences in tobacco, rice and spinach chloroplast genomes. The fragment containing rbcL gene was cloned from sweet potato chloroplast genome. Sequencing analysis indicated that this fragment was 1 627 base pairs (bp) in size. The complete open reading frame of Ipomoea batatas rbcL gene is 1 443 bp encoding a polypeptide of 480 amino acids. The restriction map of this cloned fragment was also established. The BLAST results showed that the homologies of this gene with tobacco, spinach, wheat, rice, maize, petunia, alfalfa, Arabidopsis thaliana, belladonna, grape and sugar beet were from 85% to 98%, and the homologous amino acid sequences were from 92% to 95%. Key words: sweet potato [Ipomoea batatas (L.) Lam.]; chloroplast gene; rbcL gene; sequence analyses 叶绿体基因工程作为一项转基因技术, 具有核 转化不具备的独特优点: 高效表达目的基因, 环境 因组中编码核酮糖 1 , 5 - 二磷酸羧化酶 / 加氧酶 (ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase/oxygenase, 安全性好, 消除位置效应, 无基因沉默现象, 原核基 Rubisco, E.C. 4.1.1.39)大亚基的rbcL基因高度保守 因表达方式等。但是到目前为止, 几乎所有的叶绿 (Hasebe 等 1992; Andersson 和 Backlund 2008)。本 体转化成功的报道都集中于衣藻和烟草等模式植 文报道克隆得到甘薯叶绿体rbcL基因的完整序列, 物。最近, 在油菜(Hou 等 2003)、拟南芥(Sikdar 为在甘薯中开展叶绿体基因工程建立了基础。 等 1998)、水稻(Khan 和 Maliga 1999)、马铃薯 (Sidorov 等 1999)、番茄(Maliga 2003; Wurbs 等 材料与方法 2007)、胡萝卜(Kumar 等 2004a)、矮牵牛(Zubko 甘薯[Ipomoea batatas (L.) Lam]品种 ‘ 京 3’ 无 等 2004)、大豆(Dufourmantel 等 2004, 2005)、莴 苣(Lelivelt等2005; Kanamoto等2006)、棉花(Kumar 菌苗由北京市农林科学院小麦中心提供。以不含 生长调节物的 MS 固体培养基培养, 每隔 4 周切取 等 2004b)和甘蓝(Liu 等 2007)等植物中获得成功。 茎段继代一次。 限制叶绿体转化技术扩展受体范围的主要因素之一 是大多数植物的叶绿体基因组序列尚不清楚, 因此 收稿 20 08 -0 5-26 资助 北京市自然科学基金(5 06 2 0 12 )、陕西省教育厅自然科 无法确定用于载体构建的同源重组片段和外源基因 的插入位点。有研究表明, 在高等植物的叶绿体基 修定 20 08 -0 7-21 学专项基金(06 JK17 5)和西北大学校内基金(0 5NW43 )。 　 * 通讯作者(E-mail: conglinh@126.com; Tel: 010-51503801)。 植物生理学通讯 第 44 卷 第 5 期，2008 年 10 月 883 取 30 g 左右继代培养 3 周左右的组培苗叶片, 好, 基本上无降解, 再经限制性酶切后电泳, 可以见 先在4 ℃下黑暗饥饿过夜, 之后用于叶绿体基因组 到一系列大小不同的条带, 不像基因组总DNA酶切 DNA (chloroplast DNA, cpDNA)提取。提取参考 后呈完全弥散状。由于cpDNA酶切图的背景稍强, 高盐低pH法(龚小松和阎隆飞1991), 结合2次差速 离心技术, 先分离纯化叶绿体, 后用常规 CTAB 法 所以提取的 cpDNA 还存在核基因组 DNA的污染。 但总的来说, 提取的cpDNA质量基本上可以满足后 提取叶绿体DNA, 各取2 µL cpDNA, 分别用BamHI 续试验中 PCR 扩增的要求。 和 PstI 进行酶切, 检测 cpDNA 的质量。纯化的叶 2 甘薯 rbcL 基因的克隆与序列分析 绿体 DNA 稀释到一定浓度后用于 PCR 扩增。 以S-rbcL19U和S-rbcL21L为引物, 在TaKaRa 根据烟草、水稻和菠菜叶绿体全基因组全序 的 PrimeSTAR HS DNA 聚合酶作用下, 以甘薯 列资料, 用软件 Oligo 6 设计引物, 引物序列分别为 S-rbcL19U: 5'-GGGAGGGATTTATGTCACC-3', S- cpDNA 为模板, PCR 扩增获得甘薯叶绿体 rbcL 基 因片段。电泳结果显示, PCR 产物约为 1.6 kb (图 rbcL21L: 5'-ATCTTTGTTGTATTCGGCTCA-3'。 2), 与预计的大小相符。所得 PCR 产物回收后, 将 以甘薯叶绿体基因组 DNA 为模板, 用高保真的 该片段连接到 pGEM-T 载体上, 得到重组质粒, 由 DNA聚合酶扩增包括rbcL基因在内的一段叶绿体 上海生物工程公司测序, 片段。PCR 反应在 PTC-100 Peltier 基因扩增仪上 GenBank, 登陆号为 AY942199。序列分析表明, 重 进行, 反应程序为: 94 ℃预变性 3 min; 94 ℃变性 1 min, 57 ℃退火 1 min, 72 ℃延伸 1 min, 共 30 个循 组质粒中插入片段全长 1 627 bp, 其中包含一个 1 443 bp的 rbcL 基因编码区(图 3), 推测编码 480 个 环; 最后于 72 ℃下延伸 10 min。PCR 产物以琼脂 氨基酸(图 4), 比烟草叶绿体 rbcL 基因多 9 个碱基 糖凝胶电泳分离, 目的产物用锋利的刀片割下, 用 3 个氨基酸。 测序结果已经登陆 胶回收试剂盒回收纯化, 之后克隆进pGEM-T载体, 转化大肠杆菌 DH5α菌株, 选取阳性克隆提取质粒 DNA, 酶切鉴定后测序, 并用生物信息学软件分析 核苷酸序列、氨基酸序列以及同源性与亲缘的关 系。 结果与讨论 1 甘薯叶绿体 DNA 的提取 由图 1 可以看出, 提取的甘薯 cpDNA 质量完 图 2 甘薯 rbcL 基因片段的扩增 Fig.2 Amplification of sweet potato rbcL gene fragment M: DL2000+DL15000 标记; 1: 甘薯叶绿体 rbcL 基因扩增片段。 3 甘薯叶绿体 rbcL 基因片段的酶切图谱 利用DNAMAN软件对甘薯叶绿体rbcL基因片 段进行限制性酶切分析, 限制性酶切的图谱(图5)显 示, 在筛选的 24 个常见的限制性内切酶中, 有 9 个 酶切位点位于该片段中。 图 1 甘薯 cpDNA 及其限制性酶切电泳图谱 Fig.1 Sweet potato cpDNA and its electropherogram of restriction enzyme digestion M: DL2000+DL15000 标记; 1: 甘薯 cpDNA; 2: 经 BamHI 消化后的甘薯 cpDNA; 3: 经 PstI 消化后的甘薯 cpDNA。 4 不同植物的 rbcL 基因之间的相似性比较和进化