西伯利亚鲟败血症病理学观察与病原学研究

西伯利亚鲟败血症病理学观察与病原学研究内容摘要：

第 33卷 第 2期 水 生 生 物 学 报 V o.l 3 3, N o. 2 2 0 0 9年 3月 ACTA HYDROB IOLOGICA SIN ICA M ar. , 2 0 0 9 DO I号: 1013724 / SP1 J1000012009120316 西伯利亚鲟败血症病理学观察与病原学研究 赵凤岐 曹谨玲 刘 青 (山西农业大学动物科技学院, 山西省生态畜牧与环境兽医重点实验室, 太谷 030801) 摘要: 针对西伯利亚鲟发生败血症的情况, 进行了流行病学调查、 病理学观察和 病原学研究 。病鱼主要 特征为严重 出血性败血症 , 发病率 20% 、 死亡率 15% 。主要症状为: 鱼体消瘦, 嘴肿、 四周充血, 肛门红肿, 鱼体两侧体表、腹部、 口腔及下颌充血, 尤以背鳍、 胸鳍、腹鳍及尾鳍基部充血显著, 体表溃疡, 有的伴 有水霉着生 。在对病鱼 进行流行病 学调查和病理学观察的 基础上, 从患病鱼中分离得到一 种优势 细菌, 经感染 性试验 证明对 健康西伯 利亚鲟 具有较 强的致病性, 且症状与自然发病鲟的症状相同。通过形态学、溶血性、 蛋白酶检测、生理生 化试验和 16S rRNA 基因 序列分析, 证实引起西伯利亚鲟发生败血症的病原为 嗜水气 单胞菌。药 物敏感 性试验 结果显 示, 分 离病原 菌对头 胞噻肟钠、硫酸卡那霉素、 庆大霉素、强力霉素、 氟苯 尼考、 黏杆菌素、乳酸诺氟沙星、盐酸环丙 沙星和恩 诺沙星等药 物高度敏感, 对阿莫西林等药物具有抗性。本研究结果对西伯利亚鲟病害防治和健康 养殖具有指导意义。 关键词: 西伯利亚鲟; 败血症; 病理学; 病原 学; 嗜水气单胞菌 中图分类号: S9411 4 文献标识码: A 文章编号: 1000-3207( 2009) 02- 0316-08 西伯 利 亚鲟 ( A cip enser baerii ) 隶 属于 鲟 形目 细菌分离培养。感染试验用西伯利亚鲟为该养殖场 ( A c ip enserifo rm es)、鲟科 ( A cip enser idae) 、 鲟属 ( A ci- 中的健康幼鲟。细菌分离用普通营养琼脂购自杭州 p enser) , 为软骨硬鳞鱼, 分布于 西伯利亚 河流和湖 泊。因其具有生长速度快、适应性强、成活率高、 抗 天和生物试剂公司; 普通营养肉汤购自北京奥博星 生物技术有限公司; 胰蛋白胨购自 OXO ID LTD; 兔 病力强、 营养丰富、 味道鲜美、 鱼籽酱品质高等优点, 已成为极具 开发潜力的淡 水增养殖新 品种。 2008 鲜血营养琼脂平板自行配制; 微量发酵管及其他试 剂 ( 分析纯 )均购自天津科密欧化学试剂开发中心。 年 3月, 山西省临汾市某水产养殖场西伯利亚鲟发 细菌 16S rRNA通用扩增引物由北京奥科生物公司 生了严重的疾病和死亡现象, 发病对象主要为体长 25cm、 体重 60g 以 上的西 伯利 亚 鲟。此 病传 染性 合成, PCR 所用 Buffer、dNTP、T ag 酶等均购自天根 生化科技 ( 北京 )有限公司。 强, 波及面广, 使该场 的养殖西伯利 亚鲟死亡率达 15% 。在对病鱼进行流行病学调查和病理学观察的 112 流行病学调查 对患病渔场苗种来源、养殖密 度、发病情况、管理状况等进行调查。 基础上, 从发病西伯利亚鲟的肝、 脾、 肾等脏器与溃烂 113 病理解剖与组织学观察 病灶部位肌肉中分离出优势细菌, 经形态学、 溶血性、 蛋白酶检测、生理生化试验和 16S rRNA 基因序列分 病理剖检, 观察各脏器组织的眼观病理变化。采集 病死鱼的皮肤、 肌肉、 肾脏、 肠道和胃等主要组织, 用 析以及病原菌感染性试验等方法对病原菌进行确定, 为有效控制和防治西伯利亚鲟败血症提供依据。 Bou in 氏液固定, 石蜡包埋切 片, 苏木素 伊红 ( H E ) 染色、 镜检观察组织病变。 114 病原菌分离 1 材料与方法 取病鱼和死鱼, 进行 无菌条件下, 取 5尾具典型症状 患病西伯利亚鲟于 2008年 病鱼的皮肤、 肌肉、肾脏、 肠道和胃, 以平板划线法接 种于 S1S琼脂和普通营养琼脂培养基, 置于 28e 生 3月取自山西省临汾市某水产养殖场具有出血性败 血症的个体, 共计 20尾, 用于剖检观察、 采集病料和 化培养箱倒置培养 24h, 挑取优势菌落并纯化培养 3 次。纯化后所得 菌株以 普通营 养琼脂 斜面 4e 保 111 样品和材料来源 收稿日期: 2008-08-04; 修订日期: 2008-12-25 基金项目: 山西省高校科技研究开发项目 ( 200811009) 资助 通讯作者: 赵凤岐 ( 1953) ) , 男, 汉族, 山西原 平人; 副教 授, 硕士; 主要从事动 物营养与 水产养殖 研究。 Te:l 0354-6288336; E-m a i:l nongdazhaofengq@ i sohu1 com 赵凤岐等: 西伯利亚鲟败血症病理学观察与病原学研究 2期 存, 备用。 115 病原菌感染性试验 试验用健康西伯利亚鲟 317 ( 215U / LL ) 018LL, 用超纯水补足至 50LL。 PCR 反 应条件为: 95e 预变性 5m in; 95e 变性 30s, 61e 退 体重 30) 50g, 全长 20) 25cm, 共 40尾。将待试验 火 45s, 72e 延 伸 45s, 35 个 循环; 72e 保 温 7m in。 的个体分组装在 100L 水族箱中暂养 5d后, 选取个 扩增产物用 1% 的琼脂糖凝胶进行检测, 并挑选理 体大小均 一、体 质健 康的的 西伯 利亚 鲟用于 正式 试验。 想 PCR产物 2份送北京诺赛基因组研究中心进行 测序。将测序结果与 GenBank 上公布的嗜 水气单 将分离得 到的优势菌经普通肉汤培养基培养 胞菌 16S rRNA 序列用 DNAMAN 软件进行比对, 分 24h后, 用无菌生理盐水作连续 10 倍稀释, 稀释度 -1 -11 为 10 ) 10 , 用平板法进行 细菌计数。将菌液用 析其同源性, 对病原菌进行分子水平鉴定。 117 药敏试验 将病原菌稀释成悬液后, 均匀涂布 生理 盐 水 稀 释 成 浓 度 为 1 @ 10 CFU /m L、1 @ 于营养琼脂培养基平板上, 然后用购自于杭州微生 10 CFU /mL、1 @ 10 CFU /m L 分别腹 腔和肌 肉接种 物试剂有限公司的阿莫西林、 头胞噻肟钠、 硫酸卡那 注射 5尾健康鲟, 每尾 011 m L。对照组分别腹腔和 肌肉注射等量的无菌生理盐水。注射后, 每天观察 霉素、 庆大霉素、硫酸新霉素、强力霉素、 氟苯尼考、 黏杆菌素、 乳酸诺氟沙星、盐酸环丙沙星、 恩诺沙星 发病、死亡情况, 第 25天结束试验。在整个试验过 药敏纸片贴在平板上, 在 28e 恒温箱中培养 24h观 程中, 每天正常投喂专用饲料, 水温 20) 25e , 日换 水量大约为 1 / 2。 察抑菌圈大小。 7 8 9 116 病原菌鉴定 常规鉴定方法包括形态学观察、 2 结 果 溶血性试验、 蛋白酶检测和生理生化试验。同时结 211 流行病学调查结果 合分子生物学方法进行 16S rRNA 基因序列分析。 形态学观察 观察分离菌在普通营养琼脂上生 苗种来源 2004年始, 每年从北京某鲟鱼苗种 公司购入西伯利亚鲟苗种 40万尾, 规格全长 5cm, 长的菌落形态和营养肉汤中的生长情况; 革兰氏染 平均尾重 5g左右在苗种池培育, 达 30cm 规格放入 色和荚膜染色后, 光学显微镜观察细菌的形态和染 色特性。 成鱼池分养。 养殖密度 溶血性试验 取纯化的分离菌培养物, 接种于 兔血琼脂培养基平板上, 28e 培养 24h, 观察溶血情 2 100g左右规格达 80尾 /m , 500g左 2 右规格达 25) 30尾 /m 。 管理状况 调查发现, 主要问题有四方面: 即残 况及血琼脂平板上的菌落形态。 蛋白酶的检测 取单菌落接种于含 115% 脱脂 留饵料和污物过多, 清除不及时; 随着鱼的生长, 每 个月按大小规格筛选分池不及时; 养殖密度普遍较 奶蔗糖胰蛋白胨琼脂平板上, 28e 培养 24h判定, 以 高; 死鱼处理不及时, 随处乱扔, 病鱼无隔离措施。 在接种菌生长菌落周围出现清晰溶 蛋白圈者判为 阳性。 生理生化试验 按常规方法进行葡萄糖、乳糖、 发病 情况 该水产养殖场常 年均有败血症发 生, 其中 1) 3月份为发病高峰期。部分病鱼呈急性 型, 突然死亡, 以全长 30cm 左右幼鱼最为多见, 且 蔗糖、麦芽糖、 阿拉伯糖、 木糖、七叶苷、 水杨苷、 甘露 死亡率最高; 成鱼多数病程稍长, 摄食减少或不食, 醇、 吲哚实验、VP、 MR 等生理生化试验。 16S rRNA 基因序列分析 PCR 模板 DNA 的 出血性败血症状明显, 死亡率高; 部分病鱼呈竖游转 圈神经症状, 病程长, 逐渐消瘦, 失去利用价值; 发病 制备, 参照储卫华等 [ 1] 提取细菌染色体 DNA 的方 率达 20% , 死亡率达 15% 。 法。 16S rRNA 基因序列 的 PCR 扩增与测 序, 登陆 212 病理学观察结果 Genbank, 查找已发表的气单胞菌各种 16S rRNA 序 [ 2] 列, 参照 Dorsch, et al1 的方法, 用 DNA too l软件设 剖检变化 感染发病鱼可见鱼体消瘦, 嘴肿、 四 周充血, 肛门红肿 ( 图版 Ñ -1) , 鱼体两侧体表、口腔 计 一 对 引 物。 P 1: 5c-GAAAGGTTGATGCCTAAT- 及下颌充血, 尤以背鳍、胸鳍、腹鳍及尾鳍基部充血 ACGTA-3c, P2: 5c-CGTGCTGGCAACAAAGGACAG3c。扩增反应在 PCR system 9700( AB I公司 ) 上进 显著, 有的伴有水霉着生。有些体表皮肤和肌肉坏 死、糜烂, 病变部位凹陷, 严重时可深及背腹骨板, 形 行。反 应体系 50LL, 包括 10 @ buffer( w ith M g ) 成溃疡和穿孔。鳃水肿、 色淡、 黏液多; 腹腔有弥漫 510LL, dNTP 4LL ( 2mm o l /L ), DNA 模板 410LL, 上 性溶血性红色浑浊腹水; 肠中无食, 有灰白色黏液, 下游引物 各 1LL ( 10