屋尘螨重组变应原Der p 2 的表达, 纯化及免疫学活性鉴定

屋尘螨重组变应原Der p 2 的表达, 纯化及免疫学活性鉴定内容摘要：

中 国 人 兽 共 患 病 学 报 Chinese J o ur nal of Zoo no ses 764 2009 , 25 ( 8 ) 文章编号 :1002 - 2694 ( 2009) 08 - 0764 - 04 屋尘螨重组变应原 Der p 2 的表达 、 纯化及免疫学活性鉴定 3 刘晓宇 ,吉坤美 ,高 　波 ,刘志刚 摘 　要 : 目的 　大量诱导表达含 p ET24a2Der p 2 质粒的 BL 21 工程菌 ,表达产物以重组蛋白包涵体的形式存在 ,经包涵 体洗涤与溶解后 ,使用结合 6 组氨酸的镍柱进行亲和层析纯化蛋白质 ,用梯度复性方法进行重组蛋白的复性 ,再用屋尘螨过敏 性哮喘患者阳性血清经 Western blot 方法分析 Der p 2 重组蛋白的免疫学特性 。纯化后的融合蛋白 Der p 2 具有较高的纯度 及较强的免疫活性 ,可望作为有效的屋尘螨变应原诊断试剂和疫苗的候选分子 。 关键词 : 屋尘螨 ; 重组变应原 Der p 2 ; 蛋白表达 ; 亲和层析 ; 免疫印记 　　中图分类号 :Q966 　文献标识码 :A 　　 Expression , purif ication and identif ication of the recombinant allergen Der p2 from De r ma t o p ha goi des pte r onyssi nus and investigation on its immunological activities L IU Xiao2yu ,J I Kun2mei , GAO Bo ,L IU Zhi2gang ( A l ler g y an d I m m unolog y I nstit ute , S henz hen Uni versit y , S henz hen 518060 , Chi na) ABSTRACT :The recombinant plasmid p2 ET24a2Der2p2 was firstly t ransfo rmed to E. coli J M109 and p urified. Then it was induced to exp ress in large amo unt wit h IP T G. After cent rif ugation of t he bacterial cult ures , t he bacterial pellet was re2suspen2 ded and lysed by f reezing2t hawing t reat ment and ult raso nication. The inclusion bodies were p urified by gel2filt ration and chro2 matograp hy. This highly p urified allergen was shown to po ssess good Ig E2binding activity as demo nst rated by Western blot2 ting. It suggest s t hat t his recombinant allergen can be used as a candidate in vaccine develop ment for mite allergy. 　　KEY WORDS : Derm atop ha goi des pteronyssi nus ; reco mbinant allergen Der p 2 ; p rotein exp ressio n ; affinity chro matogra2 p hy ; Western blotting 　　变态反应性疾病 ( 过敏性疾病 ) 被 W HO 认为 是当今世界重要的公共卫生学问题 , 它包括哮喘过 研制奠定基础 。 1 　材料与方法 敏性鼻炎 、 荨麻疹 、 过敏性皮炎等〔1〕。在众多的变应 原中 , 屋尘螨是最主要的变应原 ( 过敏原 ) 。自从 Chap man 首次报道用凝胶过滤等方法分离出屋尘 螨主要变应原 Der p 1 以来 , 人们已从尘螨中分离 出至少 20 种变应原 ,并对其生化性质及临床应用进 1. 1 　材料 行了研究 。在屋尘螨 10 多类变应原中 ,Der p 2 是 研制屋尘螨变应原疫苗最主要的特异性抗原 。国内 对 Der p 2 基因质粒进行了构建〔127〕 , 但对 Der p 2 重组变应原的表达 、 纯化及免疫学特性鉴定尚未见 报道 。本研究在构建 Der p 2 的原核表达载体并大 量表达的基础上 , 旨在探索屋尘螨 Der p 2 目的蛋 白的纯化方法及免疫学特性 。为进一步运用基因工 程大规模制备屋尘螨主要变应原以用于尘螨疫苗的 1. 1. 1 　重组蛋白的大量表达 　含编码 Der p 2 基 因的大肠杆菌菌株 BL21/ p E T24a 为本实验室构建 并保存 , 能够高效融合表达屋尘螨 重组蛋 白 Der p 2。 1. 1. 2 　血清标本 　血清取自深圳市第一人民医院 和深圳市儿童医院 。临床上选择对尘螨皮试阳性的 过敏性哮喘和过敏性鼻炎患者 30 例 ,所有患者无传 染病史 、 粪检虫卵为阴性 ,静脉采血 5ml ,分离血清 , 　　 　 　 3 基 金 项 目 : 国 家 863 计 划 项 目 ( No . 2002AA214011 、 2006AA02A231) 、 国家自然科学基金 ( No . 30760082) 、 粤港关 键领域重点突破项目 ( No . 20054982207) 资助 。 　　通讯作者 : 刘志刚 , Email :L ZG @szu. edu. cn 　　作者单位 : 深圳大学过敏反应和免疫学研究所 ,深圳 　518060 © 1994-2010 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net 2009 , 25 ( 8 ) 中 国 人 兽 共 患 病 学 报 Chinese J o ur nal of Zoo no ses 765 选用法玛西亚 CA P 变应原自动检测系统或 MA S T 变应原检测系统 , 收集屋尘螨特异性反应阳性达 4 级或 4 级以上的患者血清 ,分装后低温保存 。 度 1 mL/ min 。上样完毕后 , 先用平衡缓冲液充分 洗柱 ,后分别用含 50 mmol/ L 、 150 mmol/ L 和 300 mmol/ L 咪唑的平衡缓冲液进行梯度洗脱 。分步分 1. 1. 3 　主要试剂 　Taq DNA 聚合酶为 Pro mega 管收集各次的洗脱液 ,分别取样进行 SDS2PA GE 分 析 ,并用 Broadford 法测定蛋白浓度 。 1. 2. 4 　重组蛋白的纯化及变复性研究 　使用连续 洗脱制备电泳 ,分离收集到的蛋白洗脱液 ,可以进一 步提高普通 SDS2PA GE 电泳的分辨率 ,将目的产物 公司产品 ; Ni2N TA mat rix 及柱子购自 A mersham Pharmacia 公司 ; 硝酸纤维素膜是 Millpore 公司产 品 ; 生物素标记的抗人 Ig E 抗体 , HRP 标记的链霉 亲和素购自 KPL 公司 。 1. 2 　方法 粒 p E T24a2Der p 2 。根据 GenBank 提供的 Der p 2 序列设计 特异 性引 物 , 上 游引 物为 5 ’AAA CCA T TC AAA A T G A T G TAC AAA3 ’, 下游引物为 分管收集 ,装入透析袋 。采用梯度透析法进行复性 , 先用含 2 mol/ L 尿素的复性液 ( 50 mmol/ L Tris2 Cl 、 150 mmol/ L NaCl 、 1 mmol/ L GS H 、 0. 2 mmol/ L GSS G) 透析 , 再用含 0. 2mol/ L 尿素的复性液透 析 ,最后用含 0. 2mol/ L ED TA 的 PBS 透析 。 5’T TA A TC GC G GA T T T T A GC A T G A G 3 ’。 1. 2. 5 　SDS2PA GE 及免疫印迹 　表达产物经 10 % 引物由上海生工生物工程公司合成 。PCR 反应参 数为 : 94 ℃预 变 性 5 min , 接 着 94 ℃ 30s , 58 ℃ 1 min ,72 ℃ 2 min ,最后 72 ℃延伸 10 min 。将扩增产 物进行琼脂糖凝胶电泳 。 SDS2PA GE 电泳分离 ,然后将蛋白质电转移到硝酸 1. 2. 1 　表达质粒的鉴定 　用 PCR 方法鉴定表达质 1. 2. 2 　重组蛋白 Der p 2 的诱导表达 　将重组质 粒 p E T24a2Der p 2 先转化克隆菌 E. col i J M109 ,再 行提取质粒 ,转化进表达菌 BL21 。挑单菌落接种于 含 100 mg/ L 卡那霉素的 LB 液中 , 摇菌过夜 , 次日 按 2 %的接种量转接新鲜 LB 液 ,37 ℃ 240 r/ min 摇 纤维素膜 ,用含 20g/ L 小牛血清蛋白的 TBS T 37 ℃ 封闭 2h ; 洗后与 1 ∶5 稀释的屋尘螨过敏病人阳性 血清 4 ℃孵育过夜 , 洗后加入经 TBS T 稀释 ( 1 ∶ 1 000 ) 生物素标记的抗人 Ig E 抗体 ,37 ℃孵育 1h ; 洗后 ,加入经 TBS T 稀释 ( 1 ∶1 000) 的 HRP 标记的 链霉亲和素 ,37 ℃孵育 1h ; 经充分洗涤后 ,将膜片放 入新鲜配制的二氨基联苯胺 ( DAB ) 底物溶液中 , 于 室温振摇至褐色区带充分显现 ,膜放重蒸水中洗涤 , 菌至 OD600 为 0. 6 ,加 IP T G 终浓度为 1 mmol/ L ,把 转速调至 160 r/ min 继续培养 , 诱导 5h 后取 1mL 菌液 ,4 ℃离心去弃上清 ,沉淀重悬于 50μL 1 ×PBS , 取 10μL 与等量 2 ×SDS2PA GE 上样缓冲液混合 , 煮沸 3min , 取 8μL 上样进行 SDS2PA GE 电泳来检 终止显色反应 。 2 　结果与分析 2. 1 　重 组 Der p 2 表 达 质 粒 的 鉴 定 　用 质 粒 p E T24a - Der p 2 作为模板 ,使用特异性引