红星梭子蟹变应原原肌球蛋白基因的克隆, 表达及其免疫学鉴定

红星梭子蟹变应原原肌球蛋白基因的克隆, 表达及其免疫学鉴定内容摘要：

水 生 生 物 学 报 第 33卷 第 2期 Vo l .3 3, No.2 ACTA HYDROBI OLOGI CA SI NI CA 2 0 0 9年 3月 Ma r . , 2 0 0　9 DOI 号 :10.3724 /S P .J . 0000.2009.20296 红星梭子蟹变应原原肌球蛋白基因的克隆 、表达及其免疫学鉴定 吴凯威 　刘志刚 (深圳大学生命科学学院 , 深圳 　 518060) 摘要 : 克隆 、表达红星梭子蟹蟹肉 中变应原原肌球蛋白 (Tr o p o my o s i n), 并对其 免疫学 特性进 行鉴定 。 RT-PCR克隆 红星梭子蟹 (Po r t un u ss an g ui no l e nt us ) 蟹肉中变应原原肌球蛋白 的全长 基因 , 根据序 列设计 带有酶切 位点的 特异性 引 物 , 扩增蟹 Tr o p o my o s i n的完整开放阅读框 , 与 p ET-28a载体连接并转化大肠杆菌 Es c h e r i c h i a .c o l iBL21(DE3),诱 2+ 导表达后 , Ni 亲和层析柱纯化重组蛋白 , We s t e r n-b l o t 检测其免疫学活性 , 胰酶消化后进行 MALDI -TOF-MS质谱分 析鉴定 。 克隆所得蟹 T r o p o my o s i n基因包括一个编码 285个氨基酸 的开放阅读 框 。 序列分 析结果显 示所克 隆得到 的基因与已知虾 、螨 、蟑螂等的 T r o po my o s i n变应原基 因有较 高的同源 性 (>80%)。 根 据变应 原的命 名规则 , 将其 命名为 Po r s1, 并提交 Ge nBa n k数据库 , 登录号 为 EF143836。 重组蟹 Tr o p o my o s i n在大肠杆菌中能高效的表达 , 表达 2+ 产物经 Ni 亲和 层析柱纯 化后进行 We s t e r n-b l o t 检 测 , 结 果显示该重 组蛋白具 有良好的免 疫学活性 , MALDI -TOF- MS质谱分析进一步证实了该重组变应原的正确性 。 本 研究成功 克隆和 表达了 红星梭子 蟹变应 原 Tr o p o my o s i n,为 蟹过敏性疾病的诊断和 治疗奠定了基础 。 关键词 : 红星梭子蟹 ; 变应原 ; 原肌球蛋白 ;基因克隆 ; 表达 ;MALDI -TOF-MS质 谱 中图分类号 :Q344 +.1　　　文献标识码 :A　　文章编号 :1000-3207(2009)02-0296-08 　　随着生活水平不断提高 , 人们对水产品 ( 如虾 、 蟹 、鱼等 ) 的消费与日俱增 , 由此产生的过敏性疾病 也随之增加 。据伍秋容 [ 1] 研究发现 , 在 4岁以后 , 引 起患者过敏的食物变应原逐渐以虾 、蟹为主 。 其临 MAL DI -TOF-MS质谱技术对其进行了鉴定 , 现将结 果报道如下 。 1　材料与方法 床表现主要有恶心 、呕吐 、腹痛 、腹胀 、腹泻 、皮疹 、鼻 [ 2— 4] 炎 、哮喘等 , 严重的可导致休克甚至危及生命 。 1.1　材料 　红星梭子蟹 (P o r t u n u ss a n g u i n o l e n t u s ) 购自 深圳市南山菜市场 。 RNA提取试剂盒购于 Qi a g e n公 红星梭子蟹 (Po r t u n u ss a ng u i n o l e n t u s ) 是我国南 司; AMV F i r s tS t r a n dc DNAS y n t h e s i sKi t 购于 BBI 公 方食用蟹之一 , 属于梭子蟹科 、梭子蟹属 , 在我国主 要分布在南海一带 , 在日本 、夏威夷 、菲律宾等环太 司; p MD18-TVe c t o r 、限制性内切酶 Nd eI 和 Xh oI 、T4 DNA连接酶均购于 Ta k a r a公司 。 原核表达载体 p ET- 平洋沿岸的暖水区亦有分布 , 是我国南方特别是广 28a 购自 No v a g e n公司。 P r o t e o Ex t r a c tAl l -i n -On eT r y p - 东地区最常食用的水产食 品之一 。 赵 绮华等 [ 5] 运 s i nDi g e s t i o nKi t 购自英韦创津公司 。血清由深圳市第 用免疫印迹的方法分析了花蟹 (Po r t u n u sp e l o g i c us ) 的主要致敏成分为分子量 74.4k D和 48.7k D的两 一人民医院提供 : 选择临床上有吃蟹过敏史的患者 ,其 血清经法码西亚 CAP过敏原自动检测系统检测 , 收集 个蛋白 。但目前国内有关蟹变应原的分子生物学研 蟹特异性 I g E阳性且反应达 2级或 2级以上的患者血 究尚未见报道 。 本研究利用简并引物从红星梭子蟹蟹肉中克隆 清 12人份 , 另取健康 ( 无过敏病史 ) 人血清 5人份 , 分 别分装后放 -80℃低温保存备用 。 获得一个 Tr o p o my o s i n基因 , 并将该基因在大肠杆菌 1.2　方法 中表达 , 获 得 有 活 性 的 重 组 蟹 T r o p o my o s i n , 并用 1.2. 1　简并引物的设计 　从 S WI SS -PROT、T r EMBL 　　收稿日期 :2007-04-17;修订日期 :2008-07-12 基金项目 : 广东省科技重点专项 (No .2003A3080502);深圳市科技计划 (No .200326)资助 作者简介 : 吴凯威 (1981— ), 男 , 广 东省广 州市人 ;硕士研 究生 ; 研究 方向为 过敏性 疾病过 敏原 的分子 生物 学研 究。 E-mai l :v i g ou r0751@ 126.c o m;v i g o ur 0751@y a hoo .c o m.c n 通讯作者 : 刘志刚 (1959— ), 男 , 教授 , 博导 , 副院长 ;E-ma i l :l z g @s z u .e du.c n 2期 吴凯威等 : 红星梭子蟹变应原原肌球蛋白基因的克隆 、表达及其 免疫学鉴定 　 297 以及 NCBI 的数据库下载到 17个动物性变应原 Tr o p o my o s i n的核酸序列 。 利用 CLUS TALW程序对这 霉亲和素对阳性信号进一步放大 , 以 3, 3′ 5, 5-四甲 基联苯胺 (T MB) 为底物进行显色 , 进行 We s t e r n -b l o t 些序列进行同源性比对 , 确定其保守区域 。 根据保 印迹检测 。 守区域序列 , 设计并合成简并引物 ( 由上海生工合 1.2. 7　质谱鉴定 　选择目的蛋白 , S DS-PAGE电泳 成 ): Tr o p 5a : ATGGA(C/G)GC(C/A)ATCAA- 后切胶消化后进行质谱鉴定 ( 由深圳国家生化工程 技术开发中心 完成 )。 操作 过程按照 P r o t e o Ex t r a c t GAAGAAGAT GC; Al l -i n -On eTr y p s i nDi g e s t i o nKi t 试剂盒说明书进行 。 Tr o p 3b:TT A(G/A)T AGCCAG(T/A)(C/A) AGTT CGC。 从基质辅助激光解 吸电离飞 行时间 质谱 (MAL DI T OF-MS )得 到 肽 指 纹 图 谱 , 然 后 利 用 Ma s c o t 1.2.2　RT-PCR及变应 原 Tr o p o my o s i n基因的克 (www. ma t r i x s c i e n c e . c o m) 的 S wi s s P r o t51. 0 数 据库 隆与测序 　从新鲜蟹肉中提取总 RNA,提取过程按 搜索匹配序列 。 照 Qi a g e n公司试剂盒说明书进行 。 采用 AMVFi r s t S t r a n dc DNAS y n t h e s i sKi t , 以总 RNA为模板进行逆 2　结 　果 转录合成第一链 。以 RT产物 为模板进行 P CR反 2.1　蟹 Tr o p o my o s i n基因的克隆 应 , 结束反应后将目的条带连接 p MD18-T载体并转 化大肠杆菌 To p10。 经菌落 PCR验证后将阳性菌 提取的蟹肉总 RNA经反转录合 成 c DNA第一 链 , 然后以为此为模板 , 用简并引物进行 PCR扩增 。 落进行序列测定 ( 由上海生工完成 )。 扩增的产物经琼脂糖凝胶电泳 ( 图 1),在 855b p左 1.2.3　序列分析与同源性比对 　将测序所得序列 右有一 亮带 , 大 小 与理 论 预计 值 相符 。 回 收 RT- 通过 Ge n Ba n k进行序列比对 , 同时推导其相应氨基 酸序列 , 并评估推导的蛋白质的等电点和相对分子 P CR产物 并与 p MD18-TVe c t o r连接后 转化 E.c o l i T o p10。 挑取阳性菌落进行测序 , 结果用 NCBI 中的 量 (www. e x p a s y .o r g )。 利用 EMBL -EBI 的 CLUST AL BLAS T程序进行序列同源性比较 , 发现它们与 Ge n - W (1.82) 程序进行序列同源性分析 。 1.2.4　构 建 重 组 表 达 质 粒 　在 蟹 Tr o p o my o s i n Ba n k中已知的虾 、蟹 、螨 、蟑螂等的原肌球蛋白基因 (Tr o p o my o s i n) 序列同源性较高 。 c DNA的 5′ 和 3′ 末端通过 P CR反应分别引入 Nd eI 和 Xh oI 酶 切位点 , PCR引物序列如下 :C5:GGACATAT GGAGGCCATCAAG( 划线部分为 Nd eI 酶切 位 点 )和 C3: GAGCTCGAGT TAAT AGCCAGTCAG ( 划线部分为 Xh oI 酶切位点 )。 回收 PCR产物连 接到 p MD18-T载体上经测序无误后 , 提取质粒进行 Nd eI 和 Xh o 1双酶切 , 暴露出基因片段两端的 Nd eI 和 Xh o 1黏端 , 与同样 经过 Nd eI 和 Xh o 1双酶切的 p ET-28a表达载体 , 在 T4DNA连接酶作用下 16℃连 接过夜 。挑取可疑阳性重组质粒进行双酶切鉴定和 测序验