黄曲霉毒素免疫学检测方法的研究进展

黄曲霉毒素免疫学检测方法的研究进展内容摘要：

中国畜牧兽医 2010 年第 37 卷第 7 期 生理生化 33 黄曲霉毒素免疫学检测方法的研究进展 刘磊, 李小兵, 吴殿君, 王建国, 唐佳佳, 杨威, 王晓旭, 王哲 ( 吉林大学畜牧兽医学院, 长 春 130062) 摘要: 黄曲霉毒素毒性大, 在食品及饲料中分布 广, 严 重威胁 人畜的 生命健 康, 对它的检 测十分 必要, 其中 又以免疫 学检 测方法运用最广泛。作者总结了近年来国内外报道 的常见免疫分析方法, 评述 了各方法 的优劣, 并对将来 检测的发展 趋势进 行了展望。 关键词: 黄曲霉毒素; EL ISA ; 胶体金; 免疫传感器 中图分类号: S852. 44 文献 标识码: A 黄曲霉毒素( aflat ox in, AF) 属真菌毒素( m yco 文章编号: 1671 7236( 2010) 07 0033 04 了近 200 倍; 特异性强, 荧光物质、色素、 结构类似物 t ox in) , 主要由黄曲霉和寄生曲霉产生, 常见于花生 对结果无干扰; 而且回收率高, 提取方法简单, 可以 及其制品、 玉米、棉籽, 以及一些坚果类食品和饲料 进行定性和定量测定, 得到了比较广泛的应用。现 中, 它包括 B1、B2、G1 及 G2 等 10 多种, 其中以黄 行中国食品中黄曲霉毒素 B1 的测定( GB/ T 5009 23 曲霉毒素 B1( AFB1) 最为 常见, 毒性最 强。AF B1 - 2006) 国家标准之一即是运用 EL ISA 进行检测, 能引起人类及动物 的急性中毒死亡, 还能致 畸、致 检出限为 0. 01 g/ kg。 癌、 致突变, 对人畜的健康威胁极大, 因此它被世界 目前, EL ISA 检 测黄曲 霉毒素 的技 术日趋 成 卫生组织的癌症研究机构划定为 1 类致癌物。根据 熟。国内外近年已见许多报道, Saha 等( 2007) 报道 联合国粮农组织的调查, 世界上每年有 25% 的粮食 了一种基于 EL ISA 的流动装 置( flo w t hrough de 受到已确认的霉菌毒素的污染( 刘然等, 2005) , 而对 v ice) 检测红辣椒中 AF B1 与赭曲霉毒素 A ( OT A ) , 中国的配合 饲料 和饲料 原料 的调查 结果 表明, 有 检测限分别为 2 和 10 g / kg, 与单独 EL ISA 相关性 87. 5% 、 83. 9% 、77. 3% 和 60% 的玉米样本分别含 良好, 符合 EU 的限量的法定标准。许多公司开发 有 T 2 毒素、 黄曲霉毒素、烟曲霉毒素和赭曲毒素 A 了大量 ELISA 试剂盒, 这些试剂盒在适用性、检测 ( OT A) ( 王若军等, 2003) 。黄曲霉毒素的检测方法 范围及判断标准方面均有良好 的表现。如 Beaco n 从最初以薄层色谱法为主, 发展到高效液相色谱法、 公司的黄曲霉毒素检测试剂盒基于竞争性酶联免疫 酶联免疫吸附法及其他免疫学方法等普遍应用, 其 吸附检测法设计, 检测时间只需要 20 min, 检测范 中免疫学检测方法由于具有高度特异性、 高灵敏度、 围在 2. 0~ 100 ng / mL , 但为满足低成本效益需要, 快速简便等特点, 在黄曲霉毒素等真菌毒素检测上 在一些发展中国家还是不断有新的 ELISA 检测方 得到广泛应用。黄曲霉毒素的免疫学检测方法主要 法报道。如 Mut eg i 等( 2009) 建立了一种间接竞争 包括酶联免疫吸附法、免疫传感器测定及胶体金免 ELISA 检测肯尼亚西部大量的花生样本, 并借以统 疫层析法等。 计分析了黄曲霉毒素含量地区及品种分布差异。但 1 酶联免疫吸附法 酶 联 免 疫 吸 附 试 验 ( enzym e linked im mu nosor bant assay , EL ISA) 灵 敏度高, 比 薄层法提高 ELISA 也有其自身缺陷, 酶的活性易受反应条件影 响, 重 复 性 较 差, 测 定 结 果 易 出 现 假 阳 性 问 题, ELISA 试剂寿命短, 需要低温保存; 对食用油、含脂 量高的样品( 如花生等) 及葡萄酒类、 含盐量高的酱 收稿日期: 2009 11 24 油等, 在提取时要进行调节 pH 、脱盐、脱脂 等特殊 作者简介: 刘磊( 1986- ) , 男, 湖南人, 硕士生, 研究方向: 动物中 处理, 处理工作繁琐耗时。因此, EL ISA 方法检测 毒病与代谢病。 通信作者: 王哲( 1950- ) , 男, 辽宁人, 博导, 教授, 主要从事动物 中毒病与营 养代 谢病 研究。 E m ail: w angzhe500518 @ sohu. com 基金项目: 国家质量检验总局科技计划项目( 2005J0088) 。 毒素发展的方向应为快速, 方便和稳定。 2 免疫传感器 免疫传感器具 有选择性好、种类多、测试费 用 低、 适合联机化等优点; 又不受样品颜色、浊度的影 34 生理 生化 中国畜牧兽医 2010 年第 37 卷第 7 期 响, 所需仪器设备相对简单, 具有简便、 快速、 体积小 量的单克隆抗体选择性吸附提取液中的抗原物质黄 等特点, 能广泛应用于医疗、 食品分析、 工业生产、 环 曲霉毒素。20 世纪 90 年代起, 免疫亲和技 术在食 境检测等领域( 霍群等, 2003) 。近年来研究人员设 品分析领域得到了较广泛的应用, 迄今发展较为成 计了大量传感器检测 AF 。张世川( 2007) 设计的黄 熟, 已有商品化的免疫亲和微柱出售, 如美国维康公 曲霉毒素检测传感器, 线性范围有两个: 5~ 25 g/ L 、 司的产品等。国内已有不少文献报道免疫亲和柱与 g/ L , 检测下限为 5 g / L 。干宁等( 2009) H PL C 等联合运用检测黄曲霉毒素( 陈新, 2007) , 取 报道的 AF B1 纳 米金修 饰电化 学免 疫传 感器, 在 得了较好的效果。农业部油料及制品质检中心、中 1. 0~ 200 ng / mL 内呈线性关系, 检测限为 0. 5 ng/ 国农业科 学院 油料 作物 研究 所根 据 GB/ T 18979 m L, 检测时间为 20 min。M icheli 等( 2005) 报道了 2003 研制成 NYART 2004 型 AF 速测仪, 该仪器采 一种基于丝网印刷电极( screen printed elect ro des) 用的是免疫亲和层析净化 的免疫 传感器 以检测 牛奶中 的 AF M1, 检测 限为 出限为 0. 1 25 pg/ m L, 检测区间为 30~ 160 pg/ mL 。Sapsf ord T rucksess 等( 2008) 联用免疫层析柱与液相色谱进 等( 2006) 运用阵列传感器( array biosensor ) 用间接 行国际 间协 作 研究 ( collaborativ e study ) , 检 测 人 竞争 ELISA 检测谷物及坚果中 AF B1 含量, 最低检 参、 姜及模拟样本中 AF 及 OT A 的含量, 检测结果 测限为 0. 3 ng/ mL 。Ad ny i 等( 2007) 运用光波导 符合官方农业化学家协会( AOAC) 的接受标准, 因 模式谱( opt ical w ave guide light m ode spect rosco 此推荐 AOA C 官方采用此 法检测人参和姜 中 AF py, OWL S) 设计的免疫传感器检测 AFB1 和 OT A, 及 OT A 含量。 30~ 70 用竞争法在 0. 5~ 10 ng/ m L 内灵敏度高, 与 EL ISA 荧光光度法, AF B1 检 g / kg, 测定 范围为 0. 1~ 20 本法利用抗原 g / kg。 抗体反应的高灵敏、高选择等 相关性良好。P ierm arini 等( 2007) 报道了运用间歇 特点提高了试验样品的净化效果及检测灵敏度, 同 脉冲电流分析 技术( int ermit t ent pulse ampero me 时可显著减少有毒有害试剂的使用, 有利于操作人 t ry, IPA) 的电 化学免疫传 感器, 检测限为 30 pg/ 员的健康和环境保护; 但样品前处理较复杂, 需要衍 m L, 工作区间为 0. 05~ 2 ng/ m L。Wang 等( 2009) 生后进行检测, 同时所需配套设备要求较高, 操作时 运用表面等 离子 增强 荧光 光谱 ( surf ace plasmo n 需专门技术人员, 不适合大批量样本检测和大范围 enhanced fluorescence spect roscopy) 设计了一种高 推广应用。 灵敏度的 传感器检测牛奶中 AFM 1 的含量, 在 53 4 胶体金免疫层析法 m in 内可检测浓度低至 0. 6 pg/ m L 的 AFM 1。Ben 胶体金标记自问世以来发展十分迅速, 已成为 Rejeba 等( 2009) 设计了一 种基于 AFB1 抑制乙酰 继荧光素、 酶、 同位素及胶乳标记技术之后的又一新 胆碱酯酶( AChE) 的生物传感器, 线性范围在 10~ 型标记技术, 近年来越来越受到人们的重视, 在生物 60 ng/ m L 之间, 经过样本预浓缩处理后, 能检测低 医学领域特别是人类医学、兽医学检验中得到了广 至 2 ng/ mL 的 AF B1。Jin 等( 2009) 报道了一种金 泛应用。目前胶体金免疫层析试验最为广泛使用的 纳米增强压电性免疫传感器检测 AFB1, 检测限为 有两种特定的模式: 穿流形式( f low t hrough) , 又称 0. 01 ng/ m L, 检测区间为 0. 1~ 100 ng/ mL 。T an 为斑点免疫金渗滤试验( dot immune gold filt rat io n 等( 2009) 报道了一种银沉积信号放大电化学免疫传 assay, DIGFA ) ; 另 一种 为 侧 向横 流 形 式 ( lat eral 感器检测稻谷中的 AF B1, 检测限为 0. 06 ng/ m L, flo w) , 又称为胶体金免疫层析试验( gold imm uno 工作区间为 0. 1~ 10 ng/ mL 。生物传感器在检测毒 chromat og raphic assay, GICA)