大黄与黄连对二种淡水虾血细胞吞噬活性的影响

大黄与黄连对二种淡水虾血细胞吞噬活性的影响内容摘要：

第 26 卷 第 2 期 2002 年 3 月 水生生物学报 A CT A HYDR OBIO L OG ICA SI NI CA V ol. 26, N o. 2 M ar. , 2002 研究简报 大黄与黄连对二种淡水虾血细胞吞噬活性的影响 陈孝煊　吴志新　张厚梅 ( 华中农业大学水产学院, 武汉　430070) EFFECT OF RHEUM OFFICINALE AND COPTIS CHINENSIS ON THE PHAGOCYTIC ACTIVITY IN THE HEMOCYTES OF CRAYFISH, PROCAMBARUS CLARKII AND CHERAX QUADRICARINATUS CHEN Xiao-xuan, W U Zhi-x in an d Zhan g Hou -mei ( H uaz hong A gr icultural Univ ersity , W uhan　430070) 关键词: 大黄; 黄连; 克氏原螯虾; 红螯螯虾; 血细胞; 吞噬活性 Key words : Rheum of f icinale ; Cop tis chinensis; Pr ocambar us clar kii ; Cher ax q uadr icar inatus ; Hemocy tes; T he phago cytic a ct ivity 中图分类号: S 945. 4　　文献标识码: A 　　文章编号: 1000-3207( 2002) 02-0201-004 在虾类的养殖中, 疾病的预防是非常重要的。中草药对海水养殖的中国对虾的免疫促进作用已有不 少研究 [ 1— 2] , 但中草药制剂在淡水虾中的作用却未见报道。本实验通过采用大黄( Rheum of f icinale ) 和黄 连 ( Cop tis chinens is ) 对克氏 原螯虾( P rocambar us clar kii ) 和红 螯螯虾( Cher ax quadr icar inatus ) 进行拌 饵投喂, 以测定其是否能增强淡水虾免疫系统的活性并达到防病效果, 为在发展大面积 养殖淡水虾时利 用中草药防病提供依据。 1 　材料和方法 1. 1　实验虾 　红螯螯虾 为华中农 业大学水产 试验站人工 养殖的成 虾, 体 重 60—75g ; 克 氏原螯 虾从狮 子山 集贸市场购买, 体重 30—50g 。选择体态正常, 健康无病的个体 , 分别饲养 于室内水族箱( 65×45× 34cm) 中, 饲养 7—10d 后开始实验。实验期间水 温 22—25℃。 1. 2 　金黄色葡萄球菌( S tap hy lococcus aureus ) 由本院微生物实验室保存提供。将金黄色葡萄球菌在肉 汤培养基中 37℃振荡培养 24h 后, 离心集菌。用 0. 15mol / L 无菌生理盐水洗涤 3 次, 将菌液悬浮于一定 量的生理盐水中, 加入终浓度为 1. 0% 的福尔马林, 25℃灭活 24h, 离心集菌。用生理盐水调整浓度为 3× 收稿日期: 2000-07-10; 修订日期: 2001-09-12 基金项目: 武汉市重点科技项目资助 作者简介: 陈孝煊( 1962—) , 男, 福建省连江县人; 理学硕士, 副教授; 研究方向: 鱼类病理学与水产微生物学 202 　　　　　　　　　　　　水　　 生　　生　　物　　学　　报　　　　　　　　　　26 卷 108 cfu/ mL , 置 4℃冰箱保存备用。 1. 3　弧菌( V ibrio sp . ) 　为 从罗氏沼虾 ( M acr obrachium r osenbergii) 中分离 的一种病 原菌, 由 本院微生 物实验室保存提供。将弧菌在脑心浸液 琼脂培养基上 28℃培 养 24 h 后, 用 0. 15 mol / L 生理盐水洗下菌 苔, 并调整浓度为 4×106 cfu/ mL , 用于活菌攻毒。 1. 4 　 实验分组　实验分为 6 组, A : 投喂大黄的 克氏原螯虾组; B: 投喂黄连的克 氏原螯虾组; C : 投喂基 础饲料的克氏原螯虾组( 对照组) ; D: 投 喂大黄的红螯螯虾组; E: 投喂黄连 的红螯螯虾组: F: 投喂基础饲 料的红螯螯虾组( 对照组) 。 1. 5　药饲的制 作与投喂　分别称取饲料量 1. 0% 的大 黄和黄连, 煎煮, 纱布过滤。将药液均匀喷洒在饲 料中, 烘干后保存备用。以药饲分别投喂克氏原螯虾和红螯螯虾, 每 天下午投饵一次, 投饵量以第二天上 午略有剩余为准。对照组只投喂基础饲料。连续投喂 7d 后停止投喂药饲而改投基础饲料。 1. 6　取血和 血细胞吞噬 活性测定 　在用药饲 后的第 1、4、7、14、 21d 分 别取样, 每组实 验虾每 次取样 4 只。用注射器吸取虾血抗凝剂 [ 3] 0. 3mL , 从虾围心腔取血 0. 3mL , 注入离心管中, 整个取血过程在 4℃进 行。再加入 0. 6m L 0. 15mo l/ L 冷 NaCl 溶液, 摇匀, 加入 250uL 浓度为 3×108 cfu/ mL 金黄色葡萄球菌悬 液, 混匀后于 28℃保温 1h , 其间不断摇匀。再加入等量 0. 15mo l/ L 冷 Na Cl 溶液。2000 r/ min 离心 4 min , 弃上清液。每个样品做 5 张涂片, 甲醇固定, Giemsa 染色, 油镜下观察计数。按下式计算血细胞吞噬百分 比和吞噬指数。数据处理采用 t 测验。 吞噬百分比( PP ) = 100 个血细胞中参与吞噬的细胞数 ×100 100 吞噬指数( PI ) = 细 胞内总菌数 被计数具 吞噬作用的细胞数 1. 7　 攻毒试验　在实验开始后的第 21d 进行攻毒试验。弧菌浓度为 4×10 6cfu/ m L 。以 0. 1m L / 只剂量在 克氏原螯虾腹侧第 3- 4 腹节间肌肉注射。攻毒后随时观察并记录虾死亡情况, 以下式计算免疫保护率: 免疫保护率= 　对照组死 亡率- 实验组死亡率　 ×100 对照组死亡率 2　结果 2. 1　 大黄和黄连对克氏原螯虾血细胞吞噬活性的影响 大黄和黄连对克氏原螯虾血细胞吞 噬活性的影响结果见表 1。由表 1 可以看出, 投喂大黄和黄连后 第 1 d, 克氏原螯虾血细胞吞噬百分 比和吞噬指数即开始 上升, 与对 照组均有极显著差 异( P < 0. 01) 。随 着投喂时间的延长, 血细胞的吞噬活性还有一定的上升。在停药后, 血细胞的吞噬百分 比和吞噬指数均 有不同程度的下降, 但在第 21d 时仍显著高于对照组( P < 0. 05) 。 表 1　投喂大黄和黄连后克氏原螯虾血细胞的吞噬活性( X±S x) T ab. 1　T he ph agocytic act ivit y of t he hemocyt es of P. cl arkii af t er f eeding R. of f i cinale and C. chinensis 组别 吞噬活性 投药后天数和吞噬百分比及吞噬指数( Days , PI and PP) Phagocyt ic Group s act ivit y 1 4 7 14 21 A PP 67. 1±2. 61 65. 6±1. 04 65. 0±2. 15 52. 7±0. 91 41. 6±1. 78 PI 8. 76±0. 52 9. 80±0. 40 9. 10±0. 14 6. 01±0. 11 5. 48±0. 24 B PP 63. 1±3. 07 66. 1±1. 03 66. 3±1. 06 40. 7±2. 18 32. 5±1. 36 PI 8. 80±0. 74 10. 39±0. 59 10. 38±0. 89 6. 40±2. 40 5. 10±0. 11 C PP 33. 2±0. 52 46. 2±0. 61 46. 2±1. 42 31. 2±0. 59 25. 2±1. 02 PI 6. 00±0. 23 6. 70±0. 25 6. 40±0. 14 4. 92±0. 11 4. 50±0. 11 2 期 　　　　　　 　 　陈孝 煊等: 大 黄与黄连 对二种淡水 虾血细胞吞 噬活性的 影响　　　 　　　　 203 　 2. 2　 大黄和黄连对红螯螯虾血细胞吞噬活性的影响 大黄和黄连对红螯螯虾血细胞吞噬 活性的影响结果详见表 2。由表 2 可以看出, 在投喂大黄和黄连 后不同时间以及停药后, 实验组的吞噬活性均极显著或显著高于对照组( P< 0. 01 或 P < 0. 05) 。但大黄 组和黄连 组在投药期间和停 药后吞噬活性的变 化却不尽相同, 黄连 组的吞噬活 性在用药 后第 7d 降低, 而在停药后又有所升高。 表 2　投喂大黄和黄连后红螯螯虾血细胞的吞噬活性( X±S x) T ab . 2　T he p hagocyt ic activit y of t he hemocyt es 1 of C . quad ri carinayus af t er feed ing R . of f ici nale an d C . c hinensis 组别 吞噬活性 投药后天数和吞噬百分比及吞噬指数( Days , PI and PP) Phagocyt ic Group s act ivit y 1 4 7 14 21 D PP 43. 4±1. 41 59. 7±2. 06 50. 5±1. 55 44. 6±0. 89 39. 4±2. 06 PI 7. 20±0. 35 8. 91±0. 36 9. 20±0. 51 9. 40±0. 43 6. 72±0. 28 PP 63. 1±3. 10 54. 6±1. 23 43. 1±1. 88 49. 1±0. 89 51. 4±1. 07 PI 8. 24±0. 13 8. 85±0. 22 7. 80±0. 28 9. 12±2. 84 9. 30±1. 24 PP 23. 2±1. 80 33. 9±1. 20 37. 8±1. 82 32. 9±2. 08 33. 3±1. 13 PI 4. 05±0. 11 5. 01±0. 23 4. 70±0. 11 4. 42±0. 05 5. 06±0. 16 E F 2. 3　 攻毒试验结果 攻毒后 14d, 对照组克 氏原螯虾死亡率为 73. 3% , 而实验组的死亡率