6-苄氨基嘌呤(6-BA) 对紫球藻(Porphyridium purpureum) 脂肪酸生物合成的影响

6-苄氨基嘌呤(6-BA) 对紫球藻(Porphyridium purpureum) 脂肪酸生物合成的影响内容摘要：

6-苄氨基嘌呤（6-BA）对紫球藻 Porphyridium purpareum 脂肪酸生物合成的 影响 粟高敏 1，郭晓怡 1，常静宇 1，刘星辰 1，曾宪海 1,3*，孙勇 1，卢英华 2,3 ，林鹿 1* （1 厦门大学能源学院，福建 厦门 361102；2 厦门大学化学化工学院，福建 厦门 3 361105； 厦门大学 厦门市合成生物学重点实验室，福建 厦门 361005。） 摘 要 ： 本 文 研 究 不 同 浓 度 的 外 源 细 胞 分 裂 素 6- 苄 氨 基 嘌 呤 （ 6-BA ） 对 紫 球 藻 (Porphyridium purpareum)生长及合成脂肪酸含量与成分的影响。在 ASW 培养基中，添加 不同浓度的 6-BA，在一定条件下进行光照培养（25℃，8800Lux 连续光照，1L/min 连续通 气），诱导藻细胞合成并积累多不饱和脂肪酸。结果表明：随着培养时间的延长，紫球藻 的生物量逐渐增加；与对照相比，添加 0.6 mg/L~6.0 mg/L 6-BA 对紫球藻的生长有不同程 度的促进作用，其中 0.6 mg/L6-BA 对藻细胞生长的促进作用最显著，促进效果随 6-BA 浓 度升高依次递减，当浓度增加到 9.0mg/L 时，6-BA 抑制了紫球藻的生长；添加 6.0 mg/L 细 胞分裂素不仅促进紫球藻总油脂的积累，还有利于紫球藻合成不饱和脂肪酸。添加适当浓 度的细胞分裂素可明显促进藻细胞生长，同时也增加了不饱和脂肪酸的产量。 关键词：6-苄氨基嘌呤；紫球藻；生物量；脂肪酸 中国图书分类号：Q819 文献标识码： A 紫球藻 ( Porphyridium purpareum)属红藻门、原红藻纲、紫球藻目、紫球藻科的一种 单细胞红藻，细胞可生产多种活性物质，其中包括占细胞干重为 28~39%的藻体蛋白， 40~57%的胞外多糖和 9~14%的油脂[1]。油脂中包括具较高药用、保健价值的多不饱和脂肪 酸 （PUFA），且主要含有花生四烯酸（ARA）与二十碳五烯酸（EPA）[2]，ARA 和 EPA 都是人体必需的重要不饱和脂肪酸，具有广泛生理活性。ARA 不仅是机体组织细胞膜的结 构成分，在细胞内可发挥第二信使作用，参与造血和免疫调节，引起血管舒张，参与肝、 胆多种功能的调节，引起炎症反应及参与神经内分泌和促进细胞分裂等。同时， 它也是内 循环系统和中枢神经系统中起重要作用的前列腺素、环前列腺素和白三烯类等二十碳衍生 物的直接前体。另外，ARA 是成熟母乳成分之一，它对婴儿的视力和智力发育是必需的。 EPA 不仅是构成人体细胞的重要成分， 还对心血管疾病和某些炎症（如风湿性关节炎） 有特殊的预防和治疗效果[3]。 紫球藻具有生长快、 繁殖周期短的特点， 且具有较强的抗盐性，所以可利用不适于 农作物生长的滩涂等来培养生产紫球藻， 避免从深海鱼类或其它动物肝脏中提取多不饱和 脂肪酸，降低成本，因此是具有开发前途的不饱和脂肪酸资源。植物激素对植物生长发育 起着非常重要的调节作用。藻类也属于植物的一种， 已经有一些植物激素和生长类似物在 海洋藻类中被发现[4]，也有关于植物激素对微藻生长影响的报道。史成颖等 [5]研究了 6 种植 物生长调节剂对钝顶螺旋藻(Spirulina platensis)生长的影响，研究发现，赤霉素（GA）、 萘乙酸（NAA）、细胞分裂素（6-BA）、2,4-二氯苯氧乙酸（2，4-D）对螺旋藻的生长具 有明显的促进作用。时艳侠等[6]研究了 6-BA、激动素(KT)、NAA 和甲壳素等 4 种植物生长 调节剂对冈村枝管藻(Cladosiphon okamuranus)盘状体生长发育的影响。近年来，也有一些 关 于 植 物 激 素 对 微 藻 脂 肪 酸 含 量 影 响 的 研 究 。 杨 凯 等 [7] 选 出 了 最 适 合 微 藻 TH6(Oedocladium sp.)生长及脂肪酸积累的吲哚乙酸（IAA）浓度； 焦媛媛等[8]研究了 IAA 对微拟球藻生长和脂肪酸含量的影响,证明一定 IAA 浓度可以促进微拟球藻生长同时会抑制 EPA 的合成；邓晓东等[9]等验证了激素 IAA 和 脱落酸（ABA）对小球藻 (Chlorella sp.) 生 长的影响与对油脂积累的影响呈现反作用的趋势，一定浓度的激素 IAA 和 ABA 提高了小 球藻的生物量，但却抑制了油脂的积累，一定浓度下激素 IAA 和 ABA 抑制了藻细胞的生 长，但却提高了单位细胞总油脂的积累量；范新照等 [10]也得出了植物生长调节剂 2, 4-D 和 GA3 对微茫藻 18A8 (Micractinium sp.) 生长和油脂积累的影响呈现反作用趋势的结论。这 些研究对于藻类的开发利用具有重要意义。 细胞分裂素（又名 6-苄氨基嘌呤，6-Benzyl aminopurine , 6-BA )是一种人工合成的、对 人、畜安全的植物生长调节剂，1952 年由美国威尔康实验室首先合成。已有研究证实 6BA 对某些微藻生长有一定的促进作用。 黄翔鹄等 [11] 研究了 6-BA、2,4-D 对微绿球藻 (Nannochloris oculata) 生长与代谢的影响，结果表明：6-BA 和 2,4-D 在 0.1~10mg/L 的实验 浓度范围内， 对微绿球藻的生长、细胞干重、叶绿素 a 含量、光合作用强度和呼吸作用强 度都有一定的促进作用， 可作为微绿球藻的生长调节剂。高政权等 [12]研究了 6-BA 对雨生 红球藻(Haematococcus pluvialis) 中虾青素积累的影响，实验证明 10mg/L 的 6-BA 处理对雨 生红球藻积累虾青素有明显促进作用， 较高浓度 ( 20、30、50mg/L)则对藻细胞有较强致 死作用。杨晓玲等 [13]研究了 6–BA 与盐藻的生长关系，在 6-BA 质量浓度较低时，6-BA 与 盐藻生长正相关，在 6-BA 质量浓度较高时，6-BA 与盐藻生长负相关。而 6-BA 对藻类脂 肪酸含量的影响方面的研究甚少，尤其是对紫球藻生长和脂肪酸含量的影响的研究，近年 国内在植物激素对紫球藻的影响方面只见萧华山等 [14]用吲哚丁酸(IBA)、三十烷醇(TA)及其 复配形式对紫球藻的光合作用、呼吸作用、生长繁殖等生理过程进行了探讨，三者对这些 方面皆有促进作用。 本文选用紫球藻（P. purpareum）为研究对象，通过分析不同浓度 6-BA 对细胞生长和 脂肪酸组成的影响， 拟找出 6-BA 促进紫球藻生长同时促进油脂积累的最佳浓度，缩短其 生长周期，为制备多不饱和脂肪酸提供充足的原料，也为紫球藻生产脂肪酸的大规模培养 提供理论基础。 1、 材料和方法 1.1 材料 紫球藻（Porphyridium purpareum），经课题组筛选后用于本研究。 1.2 培养基 人 工 海 水 培 养 基 （ ASW ） [15] ： NaCl 27.0g/L ， MgSO4·7H2O 6.6g/L ， MgCl2·6H2O 5.6g/L ， CaCl2·2H2O 1.5g/L ， KNO3 1.0g/L ， KH2PO4 0.07g/L ， NaHCO3 0.04g/L ， 1M Tris·HCl(pH7.6) 20 mL，微量元素母液① 1 mL ，FeEDTA 溶液② 1 mL。 ① 微量元素母液（mg/L）：ZnCl2 4.0, H3BO3 60.0, CaCl2·2H2O 4.0, MnCl2·4H2O 40.0, (NH4)6 Mo7O24·4H2O 37.0。 ②FeEDTA 溶液：0 .05M Na2EDTA(pH7.6)100ml, FeCl3·4H2O 240mg。 1.3 藻种培养 取对数期的藻液 200 mL，离心去上清，用 200 mL 灭菌的 ASW 培养基悬浮，分别取 30mL 悬浮液接种于添加了不同浓度（0.0、0.6、3.0、6.0、9.0 mg/L ）6-BA 的 ASW 培养基 中，接种量为 10%，置于光照培养箱中，在 25℃、光照强度 8800 Lux、通气量 1 L/min 条 件下培养。每 48h 取样并在 604nm 下测量吸光度。 1.4 生长指标的测定 1.4.1 生物量的测定 本文用比色法测定生物量 [16]，并建立细胞干重与吸光度的关系曲线。首先取新鲜培养 液，离心（ 4000r/min ）并弃上清液，用灭菌 ASW 培养基悬浮，用 3500 r/min 离心 15 min，以新鲜 ASW 培养基作参比，在 604 nm 下测其吸光度。另外，取 25 mL 培养液用 0.7 用光孔径的玻璃纤维滤纸（预先烘干）过滤，85℃下烘干至恒重，得到光密度与藻体细胞 干重的标准曲线。将每 48h 测得的 OD 值代入到标准曲线中，即得紫球藻的生长曲线。 藻体细胞干重与 OD604nm 的关系为： 藻体细胞干重 Y=2.4951*OD604nm-0.5121 (r² = 0.997)。 1.4.2 脂肪酸组成分析和含量测定 细胞进入指数生长末期时, 离心收集藻体, 冷冻干燥，藻体研磨成粉末，用氯仿甲醇法 抽提油脂[17]。取约 0.1g 藻粉，用电子天平称其质量记为 m，加入 3mL 氯仿-甲醇（2:1）， 再加 0.8mL 蒸馏水，摇匀振荡 2min，超声震荡 5min，随后加入 1mL 氯仿和 1mL 蒸馏水， 震荡混匀 5min，4000 r/min 离心 10min，取氯仿相置于 50mL 圆底烧瓶中（烧瓶烘干，称其 质量为 ma）；再加入 2mL 氯仿，震荡 5min 混匀，4000 r/min 离心 10min，取氯仿相置于烧 瓶中，重复操作两次，用氮气将油脂吹干至恒重，称其质量记为 mb。 油脂含量（%）=[(mb-ma)/m]*100% 将抽提出的粗脂肪加入 1 mL 1 M 氢氧化钾-甲醇溶液,向混合物中加入 5 mL 含 0.113 g/L 十七酸甲酯的环己烷,在 70℃的条件下水浴加热 40min(冷凝回流)。加水静置分层，取 上层有机相用于气相质谱分析。 采 用岛 津 QP2010SE 气相 质谱 仪测 定脂 肪酸 含量 。 色 谱条 件为 ： Rtx-5MS 色谱 柱 （30m×0.25mm×0.25μm），FID 检测器；进样口温度为 260℃，检测器温度为 260℃；程 序升温:120℃保留 1 min 后,以 10℃/min 的速率升至 170℃,保持 2min，以 3℃/min 的速率升 至 260℃至分析完成；载气为氮气，压力 500 kPa，空气压力 50 kPa,氢气压力 50 kPa, 尾吹 气压力 200 kPa；分流进样，分流比 5:1, 进样量 1μL。 各脂肪酸相对含量=